血液是唯一與所有器官都有接觸的組織，攜帶著有關機體的大量寶貴信息。在理論上，檢測血液攜帶的 DNA、RNA、囊泡和細胞殘骸可以幫助人們診斷和監(jiān)控各種疾病。產(chǎn)前基因篩查是血液檢測的一個重要應用，不過其他循環(huán)生物學指標正在受到越來越多地關注，比如甲基化、RNA、微囊泡和外泌體。為了幫助大家更好的分析甲基化、分離囊泡、提取RNA、存儲樣本和分析數(shù)據(jù)，The Scientist雜志最近與多位專家學者探討了檢測不同血液生物學指標的策略，貢獻出了相應的注意事項和實驗技巧。

研究者：加州大學圣地亞哥分校副教授Louise Laurent，美國轉(zhuǎn)化基因組研究所副教授Kendall Van Keuren-Jensen

研究項目：鑒定胎盤功能障礙（Laurent）和大腦損傷（Keuren-Jensen）的循環(huán)miRNA指標

研究背景：近年來，人們在血漿或血清樣本中成功檢測到了疾病相關的RNA（exRNA）。這些細胞外RNA可以成為非侵入性的疾病診斷指標，這是RNA檢測最有前景的發(fā)展方向之一。在多種細胞受到破壞的疾病中（比如大腦損傷），循環(huán)miRNA是非常重要的生物學指標。研究這些miRNA的團隊很多，可供選擇的實驗方案也不少，不過研究者們還沒有就此達成一致。Laurent和Keuren-Jensen都是美國NIH細胞外RNA交流協(xié)會的成員，他們正在努力推動循環(huán)miRNA檢測的標準化，提升細胞外RNA研究的可重復性。

胎盤囊泡：在妊娠期間，胎盤會將包含RNA的囊泡釋放到母體血液中。Laurent希望從中鑒定胎盤疾病的miRNA指標，比如子癇前期和宮內(nèi)生長受限。她和同事正在優(yōu)化自己開發(fā)的方法，從外泌體和微囊泡提取miRNA并分析相關數(shù)據(jù)。初步研究結(jié)果顯示，母體血液中的外泌體和微囊泡都可以分離出妊娠特異性miRNA。妊娠后期的miRNA指標與胎盤組織的關系尤為密切。

大腦撞擊：Van Keuren-Jensen團隊將監(jiān)控撞擊數(shù)據(jù)的感應器裝在橄欖球運動員的頭盔中，并在橄欖球賽季中收集運動員的血液、尿液和唾液樣本。他們對這些樣本進行RNA測序，尋找與撞擊數(shù)據(jù)有關的生物學指標。研究人員使用了一系列商業(yè)化試劑盒，并且對細胞外RNA收集方法進行了比較。“使用不同的試劑盒或分離方法會造成很大的差異，”Van Keuren-Jensen說。“現(xiàn)在還很難斷言哪種試劑盒最好。”

注意事項：有些測序試劑盒使用帶“粘性”末端的短片段DNA來結(jié)合要擴增的目標分子。這些末端（被稱為接頭）可能給實驗結(jié)果帶來很大的變數(shù)。有些試劑盒產(chǎn)生的接頭二聚體比較少，但測序偏好比較大。有些試劑盒提供的接頭更隨機化，可能與某些miRNA結(jié)合得更好。“這些因素會使結(jié)果產(chǎn)生較大差異，導致難以重復的結(jié)果，”Van Keuren-Jensen說。

實驗技巧：Laurent指出，減少樣本批次、盡量由同一個人操作有助于降低結(jié)果的差異性。使用內(nèi)參（比如不受疾病影響的一種RNA）是提高結(jié)果可重復性得另一條途徑。在沒有一個通用標準的情況下，“設立內(nèi)參可以幫你去除產(chǎn)量或批次差異帶來的許多影響，”Laurent說。Van Keuren-Jensen建議大家在論文中分享自己所用的試劑盒和分離方法，因為這些信息對實驗結(jié)果的重復很有幫助。

監(jiān)控exRNA只需要采集血樣，不像腫瘤活檢那么有風險，成本也比較低。不過從血漿或血清中分離exRNA仍有一定的挑戰(zhàn)性，一方面是因為exRNA豐度低，另一方面是因為血液中的污染物會抑制PCR。商品化的試劑盒能簡化和加速exRNA提取過程，已成為循環(huán)exRNA研究不可缺少的工具。然而很少有人橫向評估這些試劑盒的提取效率如何，是否能去除血漿中的污染物，是否會偏向特定的RNA。而這類評估對于結(jié)果解釋和實驗之間的比較都很關鍵。

于是，美國愛因斯坦醫(yī)學院的研究人員評估了市場上7種常用的exRNA提取試劑盒，分別來自貝克曼•庫爾特、Life Technologies、Exiqon、Zymo、QIAGEN公司。他們具體評估了合成RNA的總體回收率、不同大小的合成RNA的回收能力、exRNA產(chǎn)量和純度，以及純化后的擴增效率。研究結(jié)果發(fā)表在《BioTechniques》雜志上。

早期非小細胞肺癌（NSCLC）是無癥狀的，并且很難檢測到，因為目前沒有可用的NSCLC血液測試。最近，在Cell子刊《EBioMedicine》發(fā)表的一項研究中，南京大學生命科學學院的張辰宇教授和南京大學附屬金陵醫(yī)院的張春妮教授帶領的研究小組，確定了一組（五個）血清microRNA（miRNA），作為NSCLC診斷的潛在生物標志物。