6月9日，國家蛋白質(zhì)科學(xué)研究（上海）設(shè)施五線六站用戶北京生命科學(xué)研究所研究員邵峰及其合作者中國科學(xué)院生物物理研究所王大成組在《自然》（Nature）雜志在線發(fā)表題為Pore-forming activity and structural autoinhibition of the gasdermin family 的長(zhǎng)文（article），揭示了GSDMD蛋白以及其它gasdermin家族蛋白介導(dǎo)細(xì)胞焦亡和在天然免疫中發(fā)揮功能的分子機(jī)理。

細(xì)胞焦亡或炎性壞死是一種程序性細(xì)胞壞死，表現(xiàn)為細(xì)胞不斷脹大直至細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的釋放進(jìn)而激活強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。細(xì)胞焦亡是機(jī)體重要天然免疫反應(yīng)，在拮抗感染和內(nèi)源危險(xiǎn)信號(hào)中發(fā)揮重要作用。過度的細(xì)胞焦亡會(huì)誘發(fā)包括敗血癥在內(nèi)的多種炎癥和免疫性疾病。傳統(tǒng)研究認(rèn)為，細(xì)胞焦亡由包括caspase-1和caspase-4/5/11在內(nèi)的炎性caspase活化而誘發(fā)。Caspase-1在病原信號(hào)誘導(dǎo)形成的炎癥小體復(fù)合物作用下被激活；實(shí)驗(yàn)室此前的工作表明caspase-4/5/11是細(xì)菌脂多糖（LPS，又稱內(nèi)毒素）的胞內(nèi)受體，在結(jié)合LPS后發(fā)生寡聚而活化，是革蘭氏陰性菌誘導(dǎo)敗血癥的關(guān)鍵因素（Shi et al., Nature 2014）。然而，20多年來人們對(duì)于炎性caspase如何誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的機(jī)理一直完全不清楚。在去年的一項(xiàng)突破性進(jìn)展中，實(shí)驗(yàn)人員找到了一個(gè)所有炎性caspase的共同底物蛋白GSDMD，炎性caspase通過切割GSDMD釋放其N端結(jié)構(gòu)域而引發(fā)細(xì)胞焦亡（Shi et al., Nature 2015）。GSDMD屬于一個(gè)被稱為gasdermin的功能未知的蛋白家族，該家族還包括GSDMA，GSDMB，GSDMC，DFNA5，DFNB59等。人的DFNA5和小鼠Gsdma3的遺傳突變分別導(dǎo)致非綜合征性耳聾和小鼠脫毛以及皮膚發(fā)炎等疾病，GSDMB基因的多態(tài)性和兒童哮喘的發(fā)生密切相關(guān)。該研究也發(fā)現(xiàn)GSDMA3蛋白雖然不是炎性caspase的底物，但其N端結(jié)構(gòu)域也能誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，并且，導(dǎo)致小鼠脫毛的突變體GSDMA3蛋白都喪失了分子內(nèi)自抑制作用進(jìn)而顯示出持續(xù)誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的活性。然而，炎性caspase切割GSDMD如何引發(fā)細(xì)胞焦亡及其它gasdermin家族蛋白在細(xì)胞焦亡相關(guān)天然免疫中如何發(fā)揮功能的機(jī)制則仍然不清楚，這也是天然免疫研究的前沿?zé)狳c(diǎn)問題。

在這項(xiàng)新的研究中，研究人員首先發(fā)現(xiàn)幾乎所有的gasdermin家族蛋白的N端結(jié)構(gòu)域都具有誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的功能，而除GSDMD外，其它家族成員并不是炎性caspase的底物，這個(gè)發(fā)現(xiàn)重新定義了細(xì)胞焦亡概念，開辟了一個(gè)新的程序性細(xì)胞壞死的研究領(lǐng)域。有意思的是，gasdermin家族的N端結(jié)構(gòu)域在細(xì)菌中也顯示出明顯的致死毒性。這一現(xiàn)象暗示gasdermin N端結(jié)構(gòu)域可能是通過直接破壞細(xì)胞膜而產(chǎn)生殺死細(xì)胞。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，他們制備了活化形式的GSDMD，GSDMA 和 GSDMA3蛋白，在體外脂質(zhì)體共沉淀的實(shí)驗(yàn)中，這三種gasdermin蛋白的N端結(jié)構(gòu)域均能夠特異地結(jié)合磷酸化磷脂酰肌醇（phosphoinositide）或心磷脂（cardiolipin），而4, 5-二磷酸磷脂酰肌醇和心磷脂分別是真核細(xì)胞和原核細(xì)胞膜上特有的磷脂，這和gasdermin N端結(jié)構(gòu)域在真核細(xì)胞和細(xì)菌中均展示出細(xì)胞毒性完全吻合。通過生物化學(xué)和熒光顯微成像的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，研究人員進(jìn)一步證實(shí)，在真核細(xì)胞焦亡過程中，活化的gasdermin N端結(jié)構(gòu)域會(huì)從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，細(xì)胞隨后出現(xiàn)體積膨脹和細(xì)胞膜向胞外吐泡的現(xiàn)象。此外，活化的gasdermin N端結(jié)構(gòu)域重組蛋白只能從真核細(xì)胞內(nèi)部破壞細(xì)胞膜，而直接加入到細(xì)胞培養(yǎng)上清中的蛋白則不能裂解細(xì)胞，這也和磷酸化磷脂酰肌醇只分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)完全吻合。

利用脂質(zhì)體泄漏實(shí)驗(yàn)，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)gasdermin N端結(jié)構(gòu)域能夠高效特異地破壞含有4, 5-二磷酸磷脂酰肌醇或心磷脂的脂質(zhì)體，導(dǎo)致其發(fā)生嚴(yán)重泄漏，利用不同尺寸葡聚糖分子，他們發(fā)現(xiàn)破壞后的脂質(zhì)體只能允許小于10納米尺度的分子被釋放，該現(xiàn)象提示gasdermin N端結(jié)構(gòu)域有可能在脂膜上聚合形成規(guī)則的孔道。生化交聯(lián)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)gasdermin N端結(jié)構(gòu)域在結(jié)合脂質(zhì)體或是在細(xì)胞焦亡中轉(zhuǎn)位上膜后都會(huì)發(fā)生高度聚合。利用負(fù)染電鏡的方法，他們首次觀察到gasdermin N端結(jié)構(gòu)域能在特異磷脂或天然磷脂組成的膜上打孔，形成很多蜂窩狀的孔道，這些孔道的內(nèi)徑約10-14 納米。進(jìn)一步的電鏡分析揭示這些分子孔道具有16重對(duì)稱性，表明gasdermin N端結(jié)構(gòu)域在膜上形成16元聚合體的孔道。此外，他們還通過對(duì)GSDMA3蛋白高分辨率晶體結(jié)構(gòu)的解析，揭示了gasdermin N端結(jié)構(gòu)域作為一種全新的打孔蛋白的獨(dú)特結(jié)構(gòu)特征，以及與C端結(jié)構(gòu)域之間的精細(xì)的自抑制相互作用。基于結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了gasdermin N端結(jié)構(gòu)域結(jié)合膜脂和在膜上打孔的特性是其誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的分子基礎(chǔ)。

該研究證明了GSDMD是炎性caspase誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的直接執(zhí)行者，首次揭示了gasdermin 家族蛋白的N端結(jié)構(gòu)域具有在膜上打孔進(jìn)而破壞細(xì)胞膜的功能，這不僅清晰闡明了炎性caspase通過GSDMD誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的分子基礎(chǔ)，也將細(xì)胞焦亡的概念重新定義為由gasdermin介導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死。研究結(jié)果不僅為針對(duì)GSDMD開發(fā)自身炎癥性疾病和敗血癥的藥物奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，也為后續(xù)研究其它gasdermin蛋白在程序性細(xì)胞壞死和天然免疫中可能的生理功能開辟了道路。

國家蛋白質(zhì)科學(xué)研究（上海）設(shè)施五線六站（BL18U1/BL19U1）為該課題結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)收集提供了支持，收到了高分率的硒帶衍射數(shù)據(jù)，直接順利解出了結(jié)構(gòu)。線站工作人員積極參與，為晶體結(jié)構(gòu)衍射數(shù)據(jù)收集提供了相應(yīng)的專業(yè)技術(shù)支持，為該成果的發(fā)表做出了有力貢獻(xiàn)。