在CRISPR/Cas9之后，DNA指導的核酸內(nèi)切酶NgAgo又登上基因組編輯的舞臺。幾個月來，NgAgo經(jīng)歷了大起大落，一開始備受矚目，最近又備受質(zhì)疑。英國醫(yī)學研究理事會（MRC）再生醫(yī)學中心的Pooran Dewari近日調(diào)查了NgAgo技術(shù)的使用情況。他認為，這種技術(shù)還需要更多時間的優(yōu)化和發(fā)展，才能真正與CRISPR正面交鋒。

NgAgo的獨特之處

Dewari首先介紹了NgAgo為何引人注目。首先，與Cas9不同，NgAgo不需要PAM序列來識別目標，這讓研究人員有了前所未有的自由，去靶定DNA中的任何序列。其次，NgAgo的特異性是由DNA指導序列決定的，而不是RNA向?qū)?。第三，它能夠靶定困難的富含GC區(qū)域，這些區(qū)域似乎耐受Cas9的切割。

當然，CRISPR/Cas9和NgAgo基因組編輯方法都有自己的優(yōu)點和缺點。NgAgo DNA向?qū)П容^便宜，可自行開展5’-磷酸化或從市場上購買。不過，與RNA向?qū)Р煌?，它不能從質(zhì)粒中產(chǎn)生。此外，NgAgo/ssDNA的體外組裝需要在55°C孵育，這個溫度對哺乳動物細胞很危險。在體內(nèi)，只有新生的NgAgo蛋白可以與ssDNA向?qū)纬蓮秃衔?。因此，研究人員必須將5’-P-ssDNA向?qū)cNgAgo表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，才能在體內(nèi)編輯基因。

NgAgo的真實體驗

自今年5月首次發(fā)表以來，NgAgo技術(shù)一直備受關(guān)注，而質(zhì)粒也被全世界的實驗室索要了400多次。研究人員都在興奮地試驗NgAgo的基因組編輯應用。他們的進展如何呢？Dewari登陸了NgAgo的谷歌論壇，發(fā)現(xiàn)許多研究人員都難以形成插入缺失。于是，他進行了一項調(diào)查，詢問他們的實驗情況，以及與CRISPR/Cas9的比較。

截至2016年8月1日，總共165名研究人員答完了調(diào)查問卷。當被問及他們是否能用NgAgo形成插入缺失時，在88名受訪者中只有1人證實，在目標位點成功形成了插入缺失。同時，41名受訪者試圖利用此技術(shù)進行表位標記，但只有1人能夠在目標位點檢測到標記的插入（knock-in）。總的來說，64%的研究人員對新方法不滿意，65%的人希望有人能優(yōu)化NgAgo的操作。絕大多數(shù)的受訪者（70%）是利用Lipofectamine方法將NgAgo導入細胞的，與最初的文章相同。

Dewari認為，盡管大多數(shù)受訪者都在努力掙扎著，但這并不意味著NgAgo沒有作用。從好的方面來看，少數(shù)受訪者的確實現(xiàn)了成功的插入缺失和表位插入，這表明NgAgo能在哺乳動物細胞中實現(xiàn)基因組編輯。

然而，大多數(shù)研究人員的現(xiàn)狀表明，NgAgo系統(tǒng)可能不容易上手。原因之一是所謂的5’-磷酸化ssDNA向?qū)У牟环€(wěn)定性，它可能被細胞機制迅速降解，使得細胞中只有少量的NgAgo/ssDNA復合物。正如原文所提到的，為了實現(xiàn)更好的效果，研究人員需要將ssDNA反復轉(zhuǎn)染。另一個可能的原因是成熟的NgAgo蛋白無法結(jié)合ssDNA向?qū)?。在翻譯過程中，也許只有小部分的新生NgAgo蛋白能夠與ssDNA形成有功能的復合物，導致下游的編輯效率不高。

總的來說，Dewari認為我們還需要更多的時間來優(yōu)化NgAgo，才能得出任何主要結(jié)論。他建議從事相關(guān)工作的研究人員在谷歌論壇、Twitter或Addgene的博客上討論，將研究成果與大家分享?；蚪M編輯領域一直在飛速發(fā)展，說不定哪天就有人開發(fā)出NgAgo的突變蛋白或全新的核酸內(nèi)切酶。