在CRISPR/Cas9之后，DNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶NgAgo又登上基因組編輯的舞臺(tái)。幾個(gè)月來(lái)，NgAgo經(jīng)歷了大起大落，一開(kāi)始備受矚目，最近又備受質(zhì)疑。英國(guó)醫(yī)學(xué)研究理事會(huì)（MRC）再生醫(yī)學(xué)中心的Pooran Dewari近日調(diào)查了NgAgo技術(shù)的使用情況。他認(rèn)為，這種技術(shù)還需要更多時(shí)間的優(yōu)化和發(fā)展，才能真正與CRISPR正面交鋒。

NgAgo的獨(dú)特之處

Dewari首先介紹了NgAgo為何引人注目。首先，與Cas9不同，NgAgo不需要PAM序列來(lái)識(shí)別目標(biāo)，這讓研究人員有了前所未有的自由，去靶定DNA中的任何序列。其次，NgAgo的特異性是由DNA指導(dǎo)序列決定的，而不是RNA向?qū)?。第三，它能夠靶定困難的富含GC區(qū)域，這些區(qū)域似乎耐受Cas9的切割。

當(dāng)然，CRISPR/Cas9和NgAgo基因組編輯方法都有自己的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。NgAgo DNA向?qū)П容^便宜，可自行開(kāi)展5’-磷酸化或從市場(chǎng)上購(gòu)買。不過(guò)，與RNA向?qū)Р煌?，它不能從質(zhì)粒中產(chǎn)生。此外，NgAgo/ssDNA的體外組裝需要在55°C孵育，這個(gè)溫度對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞很危險(xiǎn)。在體內(nèi)，只有新生的NgAgo蛋白可以與ssDNA向?qū)纬蓮?fù)合物。因此，研究人員必須將5’-P-ssDNA向?qū)cNgAgo表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，才能在體內(nèi)編輯基因。

NgAgo的真實(shí)體驗(yàn)

自今年5月首次發(fā)表以來(lái)，NgAgo技術(shù)一直備受關(guān)注，而質(zhì)粒也被全世界的實(shí)驗(yàn)室索要了400多次。研究人員都在興奮地試驗(yàn)NgAgo的基因組編輯應(yīng)用。他們的進(jìn)展如何呢？Dewari登陸了NgAgo的谷歌論壇，發(fā)現(xiàn)許多研究人員都難以形成插入缺失。于是，他進(jìn)行了一項(xiàng)調(diào)查，詢問(wèn)他們的實(shí)驗(yàn)情況，以及與CRISPR/Cas9的比較。

截至2016年8月1日，總共165名研究人員答完了調(diào)查問(wèn)卷。當(dāng)被問(wèn)及他們是否能用NgAgo形成插入缺失時(shí)，在88名受訪者中只有1人證實(shí)，在目標(biāo)位點(diǎn)成功形成了插入缺失。同時(shí)，41名受訪者試圖利用此技術(shù)進(jìn)行表位標(biāo)記，但只有1人能夠在目標(biāo)位點(diǎn)檢測(cè)到標(biāo)記的插入（knock-in）?？偟膩?lái)說(shuō)，64%的研究人員對(duì)新方法不滿意，65%的人希望有人能優(yōu)化NgAgo的操作。絕大多數(shù)的受訪者（70%）是利用Lipofectamine方法將NgAgo導(dǎo)入細(xì)胞的，與最初的文章相同。

Dewari認(rèn)為，盡管大多數(shù)受訪者都在努力掙扎著，但這并不意味著NgAgo沒(méi)有作用。從好的方面來(lái)看，少數(shù)受訪者的確實(shí)現(xiàn)了成功的插入缺失和表位插入，這表明NgAgo能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)基因組編輯。

然而，大多數(shù)研究人員的現(xiàn)狀表明，NgAgo系統(tǒng)可能不容易上手。原因之一是所謂的5’-磷酸化ssDNA向?qū)У牟环€(wěn)定性，它可能被細(xì)胞機(jī)制迅速降解，使得細(xì)胞中只有少量的NgAgo/ssDNA復(fù)合物。正如原文所提到的，為了實(shí)現(xiàn)更好的效果，研究人員需要將ssDNA反復(fù)轉(zhuǎn)染。另一個(gè)可能的原因是成熟的NgAgo蛋白無(wú)法結(jié)合ssDNA向?qū)?。在翻譯過(guò)程中，也許只有小部分的新生NgAgo蛋白能夠與ssDNA形成有功能的復(fù)合物，導(dǎo)致下游的編輯效率不高。

總的來(lái)說(shuō)，Dewari認(rèn)為我們還需要更多的時(shí)間來(lái)優(yōu)化NgAgo，才能得出任何主要結(jié)論。他建議從事相關(guān)工作的研究人員在谷歌論壇、Twitter或Addgene的博客上討論，將研究成果與大家分享?；蚪M編輯領(lǐng)域一直在飛速發(fā)展，說(shuō)不定哪天就有人開(kāi)發(fā)出NgAgo的突變蛋白或全新的核酸內(nèi)切酶。