來自麻省理工學(xué)院，Broad研究院等處的研究人員利用一個大型單導(dǎo)向RNA（sgRNA）文庫，發(fā)現(xiàn)了影響癌癥患者耐藥性的基因的非編碼調(diào)控元件，這一重要的發(fā)現(xiàn)公布在9月29日的Science雜志上，同期雜志的另外一項獨(dú)立研究采用了一種高通量 CRISPRi 篩選技術(shù)，也在距離兩種疾病相關(guān)基因1Mb（兆堿基）處發(fā)現(xiàn)了非編碼元件。

這兩項研究延伸了CRISPR在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用，分別擴(kuò)展了 CRISPRi和 CRISPR/Cas9 非編碼基因組篩選的應(yīng)用范疇。

各家點(diǎn)評

雖然之前研究人員曾利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)直接檢驗(yàn)體內(nèi)非編碼基因組元件，但目前的研究大多集中在大型篩選識別新的非編碼位點(diǎn)。

加州大學(xué)洛杉磯分校的合成生物學(xué)家Sriram Kosuri認(rèn)為，“這（兩個CRISPR篩選研究）完成了迄今為止很難做到的靶向工作，也就是天然人類基因組中與重要表型相關(guān)序列中的非編碼區(qū)域。”

“研究人員從一種全新的角度，超越之前研究，利用 CRISPR工具解析了基因表達(dá)途徑，找到了遺傳途經(jīng)如何影響耐藥性的分子機(jī)制，”來自耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的基因組研究員Sidi Chen點(diǎn)評道。

MD安德森癌癥中心的癌癥基因組研究員Traver Hart則認(rèn)為，“這是第一次在基因組中系統(tǒng)直接的分析增強(qiáng)子區(qū)域。”

張鋒研究組成果

在第一項研究中，Broad研究院的張鋒研究組采用18,000 sgRNAs文庫在三個基因（CUL3，NF1 和 NF2）周圍100個堿基范圍內(nèi)完成了一項715個堿基的CRISPR/Cas9 篩選。從中他們發(fā)現(xiàn)一些非編碼位點(diǎn)，這些位點(diǎn)如果發(fā)生突變，就會導(dǎo)致其中一個基因表達(dá)量降低。

之前的研究表明這些基因的功能缺失突變與癌癥藥物 vemurafenib的耐藥性有關(guān)，這種藥物能用于治療BRAF V600E突變的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，因此調(diào)控這些基因的啟動子和增強(qiáng)子元件備受關(guān)注。

這個研究組采用的方法并不是合成單個的 sgRNAs，而是將個體RNAs打印在類似雜交研究中的固體芯片上，然后切開RNAs，克隆進(jìn)慢病毒載體中。

研究人員在每個攜帶BRAT基因突變的人黑色素瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)入一個sgRNA，然后分別在對照組和vemurafenib組培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。利用深度測序?qū)ふ宜幬锝M細(xì)胞中富集的CRISPR 突變基因位點(diǎn)，結(jié)果他們找到了上百個突變位點(diǎn)，大多數(shù)集中在靶標(biāo)基因的5’末端，這些突變會降低基因表達(dá)，此外研究人員還發(fā)現(xiàn)CUL3周圍25個位點(diǎn)中有24個會導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄減少，和vemurafenib耐藥性。

“相比于蛋白編碼基因序列，我們對于非編碼調(diào)控元件的了解太少了，”文章作者，紐約基因組中心的Neville Sanjana說，“我們這項研究，與其它基因編輯篩選都可以幫助大家發(fā)現(xiàn)調(diào)控基因組這一重要組成部分的分子規(guī)則。”

此外，令研究人員感到驚訝的是，在這項研究中發(fā)現(xiàn)的非編碼調(diào)控元件，大部分是之前通過傳統(tǒng)技術(shù)進(jìn)行染色質(zhì)區(qū)域研究中從未發(fā)現(xiàn)過的。