如今，細(xì)胞群體的平均值數(shù)據(jù)已不再能夠滿足研究的需求。研究人員開始轉(zhuǎn)向單細(xì)胞來探索基本的生物學(xué)。在這一期的《BioTechniques》上，Jeffrey Perkel博士介紹了讓單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)成為現(xiàn)實(shí)的技術(shù)。

2015年底，巴西衛(wèi)生部門和世界衛(wèi)生組織報(bào)告，新生兒中小頭癥的發(fā)病率急劇增加。沒過多久，人們就確定了罪魁禍?zhǔn)祝赫ú《荆?span lang="EN-US">Zika）。為何這種病毒在成人中的表現(xiàn)是如何溫和，但在新生兒中卻造成災(zāi)難性的神經(jīng)畸形。單細(xì)胞生物學(xué)將告訴我們答案。

走進(jìn)寨卡病毒

加州大學(xué)舊金山分校的Arnold Kriegstein獲得了奧巴馬政府的BRAIN計(jì)劃資助，希望能分類人腦中的不同細(xì)胞。在發(fā)育的大腦中研究基因表達(dá)，這不是一個(gè)新概念，許多研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)做過，但是在大塊組織水平。這些研究鑒定出不同區(qū)域和不同發(fā)育階段的基因表達(dá)差異。不過，他們不能提供細(xì)胞特異性指紋。

為了創(chuàng)建基因表達(dá)的指紋，Kriegstein的團(tuán)隊(duì)與Fluidigm公司合作，利用自動(dòng)化的微流體平臺 – C1單細(xì)胞自動(dòng)制備系統(tǒng)。C1能夠平行捕獲800個(gè)單細(xì)胞，然后分離、逆轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增，輸出單細(xì)胞cDNA。將這種工具應(yīng)用在大腦組織上，研究人員之后在Illumina的測序儀上進(jìn)行測序，并利用分層聚類工具來分類，每一類代表一種特定的細(xì)胞類型。在最初的演示中，他們收集了600多個(gè)細(xì)胞的表達(dá)譜，并將它們分成四大類。

這些數(shù)據(jù)對于解析寨卡病毒的發(fā)病機(jī)理特別有用。其他研究人員則在研究病毒的受體。一名博士后研究人員Alex Pollen注意到，一種潛在的寨卡受體AXL，在放射狀膠質(zhì)細(xì)胞中高度富集。“如果你試圖產(chǎn)生小頭癥，這些正是你想要瞄準(zhǔn)的細(xì)胞，”Kriegstein表示。其他細(xì)胞也表達(dá)AXL，包括神經(jīng)免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和眼睛中的某些細(xì)胞，但是神經(jīng)元大多缺乏AXL表達(dá)。“你必須逐個(gè)細(xì)胞地觀察基因表達(dá)模式，”他說。“幸運(yùn)的是，我們一直這么做。”

發(fā)現(xiàn)非整倍體

其他的研究團(tuán)隊(duì)在探索單細(xì)胞時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了獨(dú)到的生物學(xué)見解。事實(shí)上，單細(xì)胞研究的文章數(shù)量在急劇增加，從2010年的46篇增長到2015年的332篇。過去的研究僅限于細(xì)胞解剖和生理學(xué)，但如今研究人員擁有新一代測序儀和質(zhì)譜儀，能夠拷問單個(gè)細(xì)胞的分子內(nèi)容。

然而，這并不是一件簡單的事。單細(xì)胞中沒有足夠的DNA或RNA用于直接測序，因此這些大分子首先必須被擴(kuò)增，這不可避免地讓人擔(dān)心擴(kuò)增偏倚。蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究并沒有這種選擇，因此研究必然會(huì)推動(dòng)儀器發(fā)展。當(dāng)然，在分析單個(gè)細(xì)胞時(shí)，區(qū)分真正信號和隨機(jī)噪聲也是相當(dāng)復(fù)雜的。

弗吉尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的助理教授Michael McConnell正利用單細(xì)胞技術(shù)來研究大腦中的遺傳變異。十五年前，他及同事利用熒光顯微鏡和染色體繪畫技術(shù)，發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物大腦中的細(xì)胞在基因組水平上并不完全相同。大約三分之一的分裂細(xì)胞要么缺失大量的遺傳物質(zhì)，要么過量，產(chǎn)生遺傳鑲嵌。

如今，McConnell與Salk研究所的Fred Gage合作對110個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行測序和SNP分析，以便深入研究“體細(xì)胞嵌合”的現(xiàn)象。他們發(fā)現(xiàn)，大腦中13-41%的細(xì)胞含有Mb大小的拷貝數(shù)變異，這些重復(fù)和缺失小于十五年前描述的非整倍體，但仍有可能影響細(xì)胞表型。“這可能改變離子通道組成，進(jìn)而直接影響生理學(xué)，”他說。

長翼的小鼠？

賓夕法尼亞大學(xué)Perelman醫(yī)學(xué)院的James Eberwine是現(xiàn)代單細(xì)胞生物學(xué)的先驅(qū)之一。自八十年代后期以來，他一直在開發(fā)和改進(jìn)在細(xì)胞水平上分析基因表達(dá)的方法。據(jù)Eberwine介紹，單細(xì)胞方法提供的信息無疑會(huì)被群體水平的信息所掩蓋。他的實(shí)驗(yàn)室已利用這種技術(shù)來記錄細(xì)胞之間的mRNA豐度差異，捕獲神經(jīng)樹突中的RNA，這個(gè)區(qū)域曾被認(rèn)為缺乏轉(zhuǎn)錄本。

不過他也強(qiáng)調(diào)，這項(xiàng)技術(shù)必須謹(jǐn)慎使用。“我想讓人們知道的是，現(xiàn)在開展單細(xì)胞分析是相對簡單的，但想要做好，并不簡單。”數(shù)據(jù)解釋和對照是關(guān)鍵。

Rusty Lansford也同意這一點(diǎn)，他是南加州大學(xué)和洛杉磯兒童醫(yī)院的副教授。與Eberwine合作，Lansford最近轉(zhuǎn)向單細(xì)胞組學(xué)，將這些技術(shù)與脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育的活細(xì)胞成像相結(jié)合。他的研究對象是日本鵪鶉。對于這類研究而言，鵪鶉是比小鼠和雞更好的選擇。Lansford稱之為“長翼的小鼠”。

Lansford的實(shí)驗(yàn)室一直在開發(fā)鵪鶉發(fā)育過程中細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的成像方法。他在一個(gè)胚胎所有細(xì)胞中利用組成型啟動(dòng)子表達(dá)紅色熒光蛋白，而另一個(gè)胚胎利用內(nèi)皮細(xì)胞特異的啟動(dòng)子表達(dá)黃色熒光蛋白，之后將動(dòng)物雜交。Lansford利用共聚焦或雙光子顯微鏡來觀察發(fā)育中的胚胎，看看每個(gè)細(xì)胞去哪里。

在發(fā)育一段時(shí)間后，他們切下特異細(xì)胞，利用免疫組化鑒定細(xì)胞類型，然后測序RNA。盡管數(shù)據(jù)還沒有發(fā)表，但是研究人員利用這種策略來標(biāo)記原始生殖細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)他們能夠觀察到每個(gè)細(xì)胞發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄組變化。這些實(shí)驗(yàn)頗有挑戰(zhàn)性，不過數(shù)據(jù)分析要困難得多。“我們必須查看某些事件，了解細(xì)胞事件的隨機(jī)性，”Lansford說。