俄羅斯科學(xué)院的研究人員近日開發(fā)出一種簡(jiǎn)單的方法，可改善免疫印跡中膜蛋白的檢測(cè)。他們?cè)谛乱黄诘摹?/span>BioTechniques》上介紹了這個(gè)成果。

利用Western blot，人們可精確鑒定復(fù)雜樣品中的特定蛋白質(zhì)。然而，每條泳道可加入的蛋白總量是有限的，這就限制了低豐度蛋白的檢測(cè)。因此，低豐度蛋白需要預(yù)先富集，才能可靠檢測(cè)。為此，研究人員設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單方法，從酵母細(xì)胞裂解液中富集膜蛋白，并制備SDS凝膠電泳的樣品。

為了確定漢遜酵母（Hansenula polymorpha）中膜蛋白Pho87的水平，研究人員一開始用了常規(guī)的方法進(jìn)行樣品制備。這就是大家熟知的：用玻璃珠破碎細(xì)胞，再用Laemmli SDS凝膠電泳緩沖液煮沸細(xì)胞裂解物。盡管每條泳道的上樣量相當(dāng)高，但全長(zhǎng)Pho87的條帶卻總是無處尋覓。相反，Pho87降解產(chǎn)物的條帶卻格外顯眼。

由于Pho87是膜蛋白，研究人員便試著通過分離裂解液中的膜組分來濃縮。他們假設(shè)，在細(xì)胞破碎過程中提高鹽濃度可保護(hù)Pho87免于降解，并刺激膜組分沉淀，從而有助于Pho87的富集。基于此，他們嘗試了不同濃度的乙酸銨和不同的孵育時(shí)間，發(fā)現(xiàn)在1 M乙酸銨中孵育2小時(shí)可明顯改善Pho87的沉降。

大家都知道，樣品煮沸可能引起膜蛋白的聚集。同時(shí)，樣品裂解液中SDS的存在可能使蛋白更容易被蛋白酶水解。事實(shí)上，即使蛋白酶抑制劑存在，研究人員還是無法在細(xì)胞裂解液中檢測(cè)到全長(zhǎng)的Pho87條帶。為了避免煮沸并確保蛋白酶迅速降解，他們采用了包含SDS和高濃度尿素的樣品緩沖液。

利用這種方法，研究人員檢測(cè)了漢遜酵母的一些蛋白，包括Pho87、Sup35、Pmr1、CPY、Gas1、Tpd3和微管蛋白，以及釀酒酵母的一些蛋白，包括Sup35、Sup45、Gas1、Hsp104、Rnq1和微管蛋白，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與常規(guī)方法進(jìn)行了比較。

他們發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)方法相比，新方法在膜相關(guān)蛋白（Pho87、Pmr1和Gas1）以及Tpd3和微管蛋白上有著更好的表現(xiàn)。Tpd3和微管蛋白的沉淀可能是由于它們與紡錘體極體的相互作用。同時(shí)，Tpd3的相當(dāng)一部分位于細(xì)胞核中，這可能也有助于其沉淀。作者認(rèn)為，將沉淀的蛋白溶解在含尿素的緩沖液中而不煮沸，大大改善了蛋白質(zhì)的檢測(cè)，特別是Pho87。