來自同濟大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京生命科學(xué)研究所等處的研究人員利用CRISPR/Cas9基因修飾系統(tǒng)構(gòu)建了Sall4基因條件性敲除小鼠，從而發(fā)現(xiàn)SALL4能作為重要的轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳調(diào)控因子參與卵母細胞成熟的調(diào)控機制。

這一研究成果公布在Journal of Biological Chemistry雜志上，研究人員應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)成功得到了條件性基因敲除的小鼠（Sall4loxP/loxP）和基因熒光標記小鼠（Sall4-mCherry），為在卵母細胞中研究Sall4基因的功能創(chuàng)造了有利條件。

領(lǐng)導(dǎo)這一研究的是同濟大學(xué)高紹榮教授，陳嘉瑜助理教授為共同通訊作者，第一作者為高紹榮教授課題組的碩士研究生許鍇和陳霞。高紹榮教授主要研究領(lǐng)域為干細胞與體細胞重編程，利用體細胞核移植與誘導(dǎo)多能干細胞技術(shù)從事哺乳動物早期胚胎發(fā)育和體細胞重編程分子機制與干細胞研究。

卵細胞的成熟關(guān)系到受精和早期胚胎發(fā)育的順利進行，是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最重要的研究方向之一。Sall4（Splat-like 4）在很多重要的生物學(xué)進程中起到關(guān)鍵作用，例如，參與胚胎干細胞的干性維持、細胞重編程、原始生殖細胞發(fā)育、精原干細胞的分化。2016年高紹榮課題組與中科院生物物理研究所朱冰課題組合作，在Molecular Cell雜志上，揭示了Sall4參與DNA羥基化的調(diào)控機制。

在這項研究中，研究人員首先利用CRISPR/Cas9基因修飾系統(tǒng)構(gòu)建了Sall4基因條件性敲除小鼠，隨后將這種小鼠與Zp3-Cre或Gdf9-Cre小鼠進行交配、繁殖和基因型篩選得到在卵母細胞中特異性敲除Sall4基因的母鼠。研究人員發(fā)現(xiàn)這種小鼠無法產(chǎn)生成熟的卵母細胞，并且這些敲除了Sall4的卵母細胞呈現(xiàn)出極低水平的DNA甲基化修飾和異常紊亂的組蛋白修飾水平。

同時研究人員還發(fā)現(xiàn)SALL4能夠調(diào)控與上述兩種組蛋白修飾相關(guān)的酶——Kdm5b、Kdm6a和Kdm6b基因的表達。他們進一步通過體外mRNA和siRNA注射的方法證實了異常水平的H3K4me3和H3K27me3修飾會導(dǎo)致一些重要的與卵細胞成熟相關(guān)基因的異常表達，從而闡釋了SALL4在卵母細胞的表觀遺傳成熟（epigeneticmaturation）上所起的重要作用。

這一研究首次觀察到Sall4基因的敲除能夠影響卵母細胞中DNA甲基化的建立，并且證明組蛋白修飾水平的穩(wěn)定對卵母細胞的轉(zhuǎn)錄組穩(wěn)定和進一步成熟具有不可或缺的作用。除此之外，研究者應(yīng)用了CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)成功得到了條件性基因敲除的小鼠（Sall4loxP/loxP）和基因熒光標記小鼠（Sall4-mCherry），為在卵母細胞中研究Sall4基因的功能創(chuàng)造了有利條件。

另外研究應(yīng)用了單細胞RNA-seq和單細胞RRBS等微量測序技術(shù)，從而解決了卵母細胞研究受制于細胞數(shù)量的問題。而且還應(yīng)用了卵母細胞體外注射的方法，巧妙地驗證了異常的組蛋白修飾對卵細胞成熟的重要作用。這些方法的應(yīng)用，充分展現(xiàn)了新技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展對生命科學(xué)研究的推動作用。