高效的基因編輯技術(shù)是基礎(chǔ)生物學(xué)和生物技術(shù)研究的核心技術(shù)，在生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域扮演著日益重要的角色?；诩?xì)菌和古菌防御系統(tǒng)建立的高效遺傳操作技術(shù)是基因組編輯領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，如利用限制性修飾（RM）系統(tǒng)建立的DNA甲基化模擬系統(tǒng)（MoDMP）和利用規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列建立的CRISPR技術(shù)。

最近發(fā)現(xiàn)，毒素-抗毒素系統(tǒng)（Toxin-Antitoxin system）通過利用位于同一操縱子上的毒素和抗毒素基因的編碼產(chǎn)物調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與死亡/休眠，使其適應(yīng)各種脅迫條件，是原核細(xì)胞中普遍存在的一種防御系統(tǒng)。這種能特異調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與死亡的機(jī)制能夠被應(yīng)用于細(xì)菌DNA克隆、蛋白表達(dá)和遺傳操作中。枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）作為一種革蘭氏陽性細(xì)菌的模式菌，其遺傳操作系統(tǒng)在各種生理代謝、信號(hào)調(diào)控以及系統(tǒng)代謝工程等研究中起著重要作用。盡管在芽胞桿菌中已建立了位點(diǎn)特異重組酶介導(dǎo)方法、反篩方法以及CRISPR-Cas9等基因編輯技術(shù)，但是革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜、細(xì)胞抵抗毒性能力強(qiáng)等特點(diǎn)導(dǎo)致遺傳操作的假陽性率高。因而，現(xiàn)有的遺傳操作方法無法高效穩(wěn)定地對芽胞桿菌等大多數(shù)的革蘭氏陽性細(xì)菌進(jìn)行基因編輯。

針對革蘭氏陽性細(xì)菌缺乏高效、穩(wěn)定的無痕遺傳操作系統(tǒng)的這一瓶頸問題，中國科學(xué)院微生物研究所病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室溫廷益研究組和軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所車永勝研究組開展了合作研究，將細(xì)菌毒素—抗毒素系統(tǒng)重編程為由抗毒素開關(guān)調(diào)控的毒素反篩模塊（Toxin Counter-selectable Cassette Regulated by an Antitoxin Switch, TCCRAS），并經(jīng)過優(yōu)化使其適用于枯草芽胞桿菌和谷氨酸棒狀桿菌等革蘭氏陽性細(xì)菌的基因編輯。首先，利用組成型與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子分別啟動(dòng)毒素與抗毒素基因表達(dá)的策略，構(gòu)建了抗毒素開關(guān)調(diào)控的毒素反篩模塊（TCCRAS）；通過篩選五種不同來源的II型TA系統(tǒng)獲得了一個(gè)高效的反篩模塊relBE，并構(gòu)建了攜帶TCCRAS系統(tǒng)的遺傳操作載體。利用該系統(tǒng)可以在枯草芽胞桿菌中高效實(shí)現(xiàn)了功能基因的缺失、插入、替換、精確點(diǎn)突變與大片段DNA的插入與刪除（最高達(dá)194.9kb），并通過插入Pspac-crtI-crtE-crtB操縱子，首次在枯草芽胞桿菌中實(shí)現(xiàn)了番茄紅素的生物合成。

此外，可以利用該系統(tǒng)進(jìn)行谷氨酸棒桿菌染色體基因的無痕敲除、替換及高達(dá)179.8kb片段的刪除，反篩與突變效率分別為100%與17.9-85.9%，明顯高于傳統(tǒng)的SacB系統(tǒng)。利用該方法成功地構(gòu)建了直接發(fā)酵法產(chǎn)戊二胺的谷氨酸棒桿菌工程菌，為今后利用谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)戊二胺奠定了基礎(chǔ)。

這一研究通過構(gòu)建抗毒素開關(guān)調(diào)控的毒素反篩模塊，成功建立了一種新型的基因編輯技術(shù)，在革蘭氏陽性細(xì)菌中實(shí)現(xiàn)了染色體基因的無痕敲除、敲入、替換、點(diǎn)突變及大片段刪除和插入。TCCRAS方法具有不引入任何標(biāo)記、遺傳穩(wěn)定、效率高、用途廣等優(yōu)點(diǎn)，其可作為一種有效的遺傳操作工具用于系統(tǒng)生物學(xué)及合成生物學(xué)研究；同時(shí)，該方法還能夠在基因組水平高效地實(shí)現(xiàn)對多種革蘭氏陽性細(xì)菌的代謝工程改造，為人工設(shè)計(jì)構(gòu)建高效的細(xì)胞工廠和新型的生物催化劑，實(shí)現(xiàn)重要化合物的生物合成提供技術(shù)平臺(tái)，提升微生物在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用價(jià)值。

這一研究進(jìn)展已于近日在線發(fā)表于ACS Synthetic Biology，中科院微生物所博士生吳杰與鄧愛華副研究員為該文的第一作者，溫廷益研究員與車永勝研究員為通訊作者。該研究得到國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2014AA021203）、國家自然科學(xué)基金（31570083和31170103）、中國科學(xué)院科技服務(wù)網(wǎng)絡(luò)計(jì)劃（STS計(jì)劃）（KFJ-EW-STS-078）和中國科學(xué)院重點(diǎn)部署項(xiàng)目（KGZD-EW-606）的資助。