高效的基因編輯技術(shù)是基礎(chǔ)生物學(xué)和生物技術(shù)研究的核心技術(shù)，在生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域扮演著日益重要的角色?；诩毦凸啪烙到y(tǒng)建立的高效遺傳操作技術(shù)是基因組編輯領(lǐng)域的研究熱點，如利用限制性修飾（RM）系統(tǒng)建立的DNA甲基化模擬系統(tǒng)（MoDMP）和利用規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列建立的CRISPR技術(shù)。

最近發(fā)現(xiàn)，毒素-抗毒素系統(tǒng)（Toxin-Antitoxin system）通過利用位于同一操縱子上的毒素和抗毒素基因的編碼產(chǎn)物調(diào)節(jié)細胞的生長與死亡/休眠，使其適應(yīng)各種脅迫條件，是原核細胞中普遍存在的一種防御系統(tǒng)。這種能特異調(diào)節(jié)細胞生長與死亡的機制能夠被應(yīng)用于細菌DNA克隆、蛋白表達和遺傳操作中?？莶菅堪麠U菌（Bacillus subtilis）作為一種革蘭氏陽性細菌的模式菌，其遺傳操作系統(tǒng)在各種生理代謝、信號調(diào)控以及系統(tǒng)代謝工程等研究中起著重要作用。盡管在芽胞桿菌中已建立了位點特異重組酶介導(dǎo)方法、反篩方法以及CRISPR-Cas9等基因編輯技術(shù)，但是革蘭氏陽性細菌的細胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜、細胞抵抗毒性能力強等特點導(dǎo)致遺傳操作的假陽性率高。因而，現(xiàn)有的遺傳操作方法無法高效穩(wěn)定地對芽胞桿菌等大多數(shù)的革蘭氏陽性細菌進行基因編輯。

針對革蘭氏陽性細菌缺乏高效、穩(wěn)定的無痕遺傳操作系統(tǒng)的這一瓶頸問題，中國科學(xué)院微生物研究所病原微生物與免疫學(xué)重點實驗室溫廷益研究組和軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所車永勝研究組開展了合作研究，將細菌毒素—抗毒素系統(tǒng)重編程為由抗毒素開關(guān)調(diào)控的毒素反篩模塊（Toxin Counter-selectable Cassette Regulated by an Antitoxin Switch, TCCRAS），并經(jīng)過優(yōu)化使其適用于枯草芽胞桿菌和谷氨酸棒狀桿菌等革蘭氏陽性細菌的基因編輯。首先，利用組成型與誘導(dǎo)型啟動子分別啟動毒素與抗毒素基因表達的策略，構(gòu)建了抗毒素開關(guān)調(diào)控的毒素反篩模塊（TCCRAS）；通過篩選五種不同來源的II型TA系統(tǒng)獲得了一個高效的反篩模塊relBE，并構(gòu)建了攜帶TCCRAS系統(tǒng)的遺傳操作載體。利用該系統(tǒng)可以在枯草芽胞桿菌中高效實現(xiàn)了功能基因的缺失、插入、替換、精確點突變與大片段DNA的插入與刪除（最高達194.9kb），并通過插入Pspac-crtI-crtE-crtB操縱子，首次在枯草芽胞桿菌中實現(xiàn)了番茄紅素的生物合成。

此外，可以利用該系統(tǒng)進行谷氨酸棒桿菌染色體基因的無痕敲除、替換及高達179.8kb片段的刪除，反篩與突變效率分別為100%與17.9-85.9%，明顯高于傳統(tǒng)的SacB系統(tǒng)。利用該方法成功地構(gòu)建了直接發(fā)酵法產(chǎn)戊二胺的谷氨酸棒桿菌工程菌，為今后利用谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)戊二胺奠定了基礎(chǔ)。

這一研究通過構(gòu)建抗毒素開關(guān)調(diào)控的毒素反篩模塊，成功建立了一種新型的基因編輯技術(shù)，在革蘭氏陽性細菌中實現(xiàn)了染色體基因的無痕敲除、敲入、替換、點突變及大片段刪除和插入。TCCRAS方法具有不引入任何標(biāo)記、遺傳穩(wěn)定、效率高、用途廣等優(yōu)點，其可作為一種有效的遺傳操作工具用于系統(tǒng)生物學(xué)及合成生物學(xué)研究；同時，該方法還能夠在基因組水平高效地實現(xiàn)對多種革蘭氏陽性細菌的代謝工程改造，為人工設(shè)計構(gòu)建高效的細胞工廠和新型的生物催化劑，實現(xiàn)重要化合物的生物合成提供技術(shù)平臺，提升微生物在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等多個領(lǐng)域中的應(yīng)用價值。

這一研究進展已于近日在線發(fā)表于ACS Synthetic Biology，中科院微生物所博士生吳杰與鄧愛華副研究員為該文的第一作者，溫廷益研究員與車永勝研究員為通訊作者。該研究得到國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）（2014AA021203）、國家自然科學(xué)基金（31570083和31170103）、中國科學(xué)院科技服務(wù)網(wǎng)絡(luò)計劃（STS計劃）（KFJ-EW-STS-078）和中國科學(xué)院重點部署項目（KGZD-EW-606）的資助。