一直以來科學(xué)家們都希望能了解我們?nèi)梭w在清醒狀態(tài)下的大腦活動(dòng)規(guī)律，但要實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)并不容易，近期來自北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的研究人員在在清醒猴認(rèn)知行為條件下，最終實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定時(shí)間超過6個(gè)月的雙光子成像，這無疑為神經(jīng)科學(xué)研究帶來了新希望。

這一研究成果在線公布在2月16日的Neuron雜志上，文章的通訊作者是北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院和麥戈文腦科學(xué)研究所唐世明研究員，第一作者為北京大學(xué)生命科學(xué)中心2014級(jí)博士生李明。唐世明早年畢業(yè)于北航，曾獲第九屆中國青年科技獎(jiǎng)，入選新世紀(jì)“百千萬人才工程”國家級(jí)人選等。研究組主要研究方向是采用電極陣列、光學(xué)成像、分子生化、雙光子等研究技術(shù)，分析包括視覺皮層在內(nèi)的復(fù)雜神經(jīng)線路，研究視覺系統(tǒng)如何同時(shí)產(chǎn)生形狀識(shí)別的選擇性和不變性。

實(shí)時(shí)觀測(cè)大腦中發(fā)生的活動(dòng)，有助于科學(xué)家了解我們大腦運(yùn)作的規(guī)律，找到治療疾病的新方法。傳統(tǒng)的成像方法需要停止組織的細(xì)胞活動(dòng)，而雙光子成像技術(shù)，能以單細(xì)胞至單突觸分辨率，觀察腦皮層大量神經(jīng)元活動(dòng)，近年來在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。

獼猴在認(rèn)知行為、腦結(jié)構(gòu)及功能方面都接近于人類，是人類腦疾病、視覺認(rèn)知及其他高級(jí)認(rèn)知功能研究理想的模式動(dòng)物。由于大動(dòng)物存在腦表面組織增生嚴(yán)重、腦組織跳動(dòng)大、基因編碼探針的表達(dá)效率低等困難，清醒猴長時(shí)期的雙光子成像一直未能實(shí)現(xiàn)，成為該領(lǐng)域研究的一個(gè)技術(shù)瓶頸。

在這篇文章中，研究人員通過在猴視覺皮層顯微注射腺相關(guān)病毒（AAV），轉(zhuǎn)入基因編碼探針，實(shí)現(xiàn)了清醒猴長時(shí)期雙光子成像。新設(shè)計(jì)的成像窗口能有效防止顱內(nèi)感染及硬腦膜增生，保持長達(dá)數(shù)月的穩(wěn)定光學(xué)質(zhì)量。AAV介導(dǎo)的基因編碼探針，包括鈣探針GCaMP5和GCaMP6s ，可以在猴視覺皮層獲得長時(shí)期高效和穩(wěn)定的表達(dá)。通過改進(jìn)頭部固定裝置以及圖像移動(dòng)修正，獲得了穩(wěn)定的圖像和高質(zhì)量的神經(jīng)活動(dòng)信號(hào)，最終在清醒猴認(rèn)知行為條件下，實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定時(shí)間超過6個(gè)月的雙光子成像。

這項(xiàng)還首次實(shí)現(xiàn)了在清醒猴雙光子成像下，同時(shí)進(jìn)行神經(jīng)元胞內(nèi)記錄及單細(xì)胞電轉(zhuǎn)等電生理研究及操作，證明了鈣探針信號(hào)與神經(jīng)元活動(dòng)大范圍的線性關(guān)系（10Hz - 150Hz），并能實(shí)現(xiàn)猴腦皮層神經(jīng)元稀疏轉(zhuǎn)染和樹突成像。

雙光子顯微鏡在實(shí)驗(yàn)生物學(xué)中正變得越來越有必要。其應(yīng)用范圍包括追蹤細(xì)胞和亞細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，監(jiān)控稀有事件，并記錄小型結(jié)構(gòu)的高速信號(hào)。神經(jīng)元樹突和樹突棘很小，而神經(jīng)電生理信號(hào)又很快，如膜電位或離子濃度的瞬變，這使得這些結(jié)構(gòu)的功能研究必須使用高時(shí)空分辨率的記錄方法。

在這方面，傳統(tǒng)的雙光子顯微鏡，再加上對(duì)生理參數(shù)敏感的熒光指示劑，只提供了部分解決方案，帶來了近衍射極限的空間分辨率。這是因?yàn)閭鹘y(tǒng)的雙光子顯微鏡使用相對(duì)較慢的束掃描方法，它嚴(yán)重限制了功能數(shù)據(jù)可被記錄的程度。而現(xiàn)代高速雙光子成像系統(tǒng)的發(fā)展越來越快，已經(jīng)在多個(gè)研究領(lǐng)域中取得了進(jìn)展。