研究顯示自動(dòng)化末端染色的Sanger測(cè)序方法能檢測(cè)常見的三種細(xì)菌表觀遺傳學(xué)標(biāo)記4-mC, 5-mC和6-mA。DNA模板中的甲基會(huì)影響雙脫氧終止法的核苷酸編入，與無(wú)修飾的對(duì)照DNA樣品數(shù)據(jù)比較時(shí)，會(huì)引起熒光示蹤色譜圖的峰值變化。當(dāng)模板含6-mA時(shí)T信號(hào)較高，含5-mC時(shí)G信號(hào)較低，而含4-mC時(shí)G信號(hào)較高，以此可以區(qū)分不同的胞嘧啶修飾形式。該方法已用于檢測(cè)幽門螺桿菌、E. coli和腦膜炎奈瑟氏菌中的甲基轉(zhuǎn)移酶。不過(guò)就我們所知，這一方法并沒(méi)有廣泛應(yīng)用于細(xì)菌基因組甲基化檢測(cè)?？赡苁怯捎谠摲椒ǖ玫降男盘?hào)量級(jí)較小，且Sanger測(cè)序本身通量相對(duì)較低。我們也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)應(yīng)用這種方法檢測(cè)其他DNA堿基修飾的嘗試。

第二代DNA測(cè)序技術(shù)依賴樣品制備階段的DNA擴(kuò)增，這會(huì)造成堿基修飾的損失，并且阻礙了測(cè)序手段在檢測(cè)堿基修飾上的應(yīng)用。因此，堿基修飾位點(diǎn)研究主要集中在應(yīng)用各種樣品前處理技術(shù)，間接推測(cè)堿基修飾的存在。通過(guò)重亞硫酸鹽測(cè)序，第二代測(cè)序被廣泛用于檢測(cè)5-mC的豐度和動(dòng)態(tài)調(diào)控。此外有文獻(xiàn)描述了一種應(yīng)用MspJI家族限制性內(nèi)切酶的方法。這種酶識(shí)別DNA中的5-mC或5- hmC，并在堿基修飾的上游12個(gè)堿基和下游16個(gè)堿基處切割一個(gè)短DNA片段。提取這些片段進(jìn)行第二代測(cè)序，就能確定基因組中堿基修飾的位點(diǎn)。這種酶對(duì)于胞嘧啶修飾側(cè)面的不同堿基有偏好，因此在建立全基因組修飾圖譜時(shí)會(huì)造成偏頗。重亞硫酸鹽和MspJI介導(dǎo)的測(cè)序目前都無(wú)法區(qū)分5-mC 和5-hmC。

科學(xué)家為了檢測(cè)其他堿基修飾，采用了針對(duì)特定修飾的富集方法。Pull-down方法利用抗體或修飾特異性結(jié)合蛋白選擇性富集含堿基修飾的DNA片段，并進(jìn)行高通量的DNA第二代測(cè)序，在測(cè)序片段上至少存在一個(gè)堿基修飾就能被檢測(cè)到。然而，這種方法并不能得到確切修飾位點(diǎn)和哪條DNA鏈被修飾的信息。有文獻(xiàn)描述了5-hmC DNA的不同富集方法，以及用于檢測(cè)堿基J在基因組分布的anti-J抗體富集方法。

檢測(cè)DNA修飾的新興測(cè)序方法

將DNA測(cè)序靈敏度推至分析極限，并能得到單個(gè)DNA分子序列的新技術(shù)引起了科學(xué)家的廣泛興趣。開發(fā)這種新技術(shù)的動(dòng)力之一，就是希望應(yīng)用測(cè)序技術(shù)讀取DNA堿基修飾信息。研究人員已采用了多種不同技術(shù)進(jìn)行這方面的研究，有些技術(shù)已經(jīng)商業(yè)化。

Helicos Biosciences的商業(yè)化技術(shù)采用在第二代測(cè)序基礎(chǔ)上產(chǎn)生的gated sequencing-by-synthesis進(jìn)行單分子測(cè)序。該技術(shù)結(jié)合DNA聚合酶和熒光標(biāo)記技術(shù)，單獨(dú)的DNA分子在一次一個(gè)堿基的延伸過(guò)程中能同時(shí)被檢測(cè)到，檢測(cè)步驟后末端基團(tuán)被移除。該技術(shù)并不需要目標(biāo)DNA的擴(kuò)增，測(cè)序的成功依賴于在成像前DNA鏈上核苷酸的完全編入，所以可能難以找到一種方法能使該技術(shù)直接對(duì)DNA模板中的堿基修飾敏感。有文獻(xiàn)報(bào)道科學(xué)家結(jié)合一種5-hmC特異性富集方法，應(yīng)用該技術(shù)對(duì)胚胎干細(xì)胞中5-hmC DNA片段成功進(jìn)行了全基因組作圖。不過(guò)很可惜，Helicos Biosciences目前面臨關(guān)閉，能否過(guò)關(guān)尚未可知。