奇妙的生物世界總是帶給我們?cè)S多驚喜，對(duì)于“堿基”這一每位分子生物學(xué)的學(xué)子最熟悉的名詞，經(jīng)過多年的研究發(fā)展，出現(xiàn)了更多的新意義，成為了最熟悉的陌生人，第五種，六種，甚至第七，八種堿基相繼被發(fā)現(xiàn)。但是要揭開這些新型堿基神秘的面紗并不容易——我們?nèi)狈δ茉谌蚪M范圍內(nèi)對(duì)這些堿基單個(gè)水平高分辨率的分析手段。

 

近期來(lái)自芝加哥大學(xué)等處的研究人員在Cell雜志上報(bào)道了一種稱為“TAB-Seq”的新方法，這種方法能直接檢測(cè)第六種堿基：5-hmC，找到每個(gè)修飾位點(diǎn)上相對(duì)豐富的5hmC，利用這一方法，研究人員還完成了第一張單堿基高分辨率的5-hmC全基因組圖譜，這無(wú)疑是一個(gè)重大突破，由此我們就能更深入的了解哺乳動(dòng)物基因組所有5-hmC的精確定位，找到這種DNA修飾與細(xì)胞分化，腦功能，以及癌癥等疾病的關(guān)聯(lián)。

 

領(lǐng)導(dǎo)這一研究的是芝加哥大學(xué)華裔科學(xué)家何川教授，他曾榮獲美國(guó)癌癥研究青年科學(xué)家獎(jiǎng)，以及凱克基金會(huì)醫(yī)學(xué)研究杰出青年學(xué)者獎(jiǎng)等多個(gè)獎(jiǎng)項(xiàng)，近年來(lái)在甲基化修飾，尤其是5hmC修飾等方面獲得了許多重要的發(fā)現(xiàn)，比如其研究組曾在2011年完成了首張哺乳動(dòng)物5hmC修飾圖譜（Nature Biotechnol., 2011, 29, 68-72）。

 

5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）

 

數(shù)十年前就知道，哺乳動(dòng)物DNA胞嘧啶堿基有兩種修飾：5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶。在這些年里，5-mC得到廣泛的研究，作為一種穩(wěn)定且重要的表遺傳修飾，參與基因表達(dá)調(diào)控、X-染色體失活、基因組印記、轉(zhuǎn)座子的長(zhǎng)期沉默和癌癥的發(fā)生，被稱為基因組第五堿基；而5羥甲基胞嘧啶的存在，由于技術(shù)的限制，一直未能得到確認(rèn)。

 

這種堿基是5-mC的羥基化形式，1952年在噬菌體DNA中首次發(fā)現(xiàn)。2009年，研究發(fā)現(xiàn)，Tet蛋白可以氧化5-mC，使之變成5hmC，后來(lái)又有研究人員發(fā)現(xiàn)一種通過Tet蛋白的三步氧化步驟，能令5mC氧化，然后堿基切除逆轉(zhuǎn)5mC，變回原來(lái)的胞嘧啶，其中5hmC是中間產(chǎn)物。

 

2009年之前，羥甲基胞嘧啶的研究一直圍繞著它對(duì)于噬菌體DNA的保護(hù)作用。直到最近，人們發(fā)現(xiàn)它與多個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞功能有關(guān)，包括胚胎干細(xì)胞發(fā)育、正常的骨髓細(xì)胞生成和受精卵發(fā)育。

 

TAB-Seq技術(shù)

 

但是對(duì)于這種關(guān)鍵的表觀遺傳修飾，我們卻無(wú)法定位它，了解它在每個(gè)修飾位點(diǎn)上的相對(duì)豐度，傳統(tǒng)的親和純化等技術(shù)做不到，發(fā)現(xiàn)基因組中5mC的標(biāo)準(zhǔn)方法——亞硫酸氫鹽測(cè)序，也無(wú)法區(qū)分5-mC和5-hmC。我們迫切需要一種能逐個(gè)逐個(gè)堿基讀取DNA，詳細(xì)檢測(cè)這些修飾在特異組織或細(xì)胞類型中位置的方法。

 

TAB-Seq就是這樣一種新技術(shù)，何教授介紹道，“這是一種單堿基高分辨率測(cè)序方法，這種方法也能找到每個(gè)修飾位點(diǎn)上的5hmC，以及其底物，其中定量數(shù)據(jù)是了解5hmC生物學(xué)的關(guān)鍵所在。”

 

這種利用Tet輔助的重亞硫酸鹽測(cè)序技術(shù)，與傳統(tǒng)的重亞硫酸鹽測(cè)序技術(shù)結(jié)合，能在基因組范圍內(nèi)以單個(gè)堿基的高分辨率完成5hmC和5mC定位，描述出其分布的圖譜。

 

在最新這篇文章中，何教授等人就利用這一技術(shù)，對(duì)來(lái)自人類和小鼠胚胎干細(xì)胞的DNA中的5-mC和5-hmC進(jìn)行了定位，獲得了關(guān)于它們分布模式的新信息，并完成了第一張單堿基高分辨率的5-hmC全基因組圖譜。

 

5hmC的奧秘

 

這項(xiàng)研究不僅揭示了5-mC和5-hmC的分布模式，而且還指出了這些DNA修飾在諸如細(xì)胞分化、癌癥和腦功能等基本生命過程中發(fā)揮的重要作用。

 

何川教授說(shuō)，“其中主要的發(fā)現(xiàn)包括：

 

1.豐度高的5hmC定位在遠(yuǎn)程基因調(diào)控元件上，這說(shuō)明了這些調(diào)控元件在主動(dòng)去甲基化過程中的作用。我認(rèn)為關(guān)鍵是要將5hmC與增強(qiáng)子，以及其它功能元件聯(lián)系在一起，因此高豐度5hmC（10%豐度）中大約有一半與調(diào)控基因表達(dá)的功能元件存在關(guān)聯(lián)。

 

2.5hmC是不對(duì)稱，并具有鏈偏向性?！?/SPAN>

 

“這指出主動(dòng)去甲基化過程復(fù)雜得多，而且我認(rèn)為實(shí)際上基礎(chǔ)生物進(jìn)程中存在的主動(dòng)去甲基化，比我們預(yù)期的更多。許多這些通過5hmC的去甲基化將會(huì)影響癌癥，以及神經(jīng)退行性疾病?！?/SPAN>

 

近年來(lái)關(guān)于5hmC的研究成果越來(lái)越多，可謂是一個(gè)熱門研究領(lǐng)域，何川教授說(shuō)，“下一步需要了解的是5hmC在去甲基化中的作用，以及其與轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用。另外一個(gè)十分重要的方面，就是繪制人類和其它哺乳動(dòng)物大腦組織和神經(jīng)元中5hmC的分布圖，5hmC在大腦中大量積累，我們需要了解它在大腦中的功能。

 

 除此之外，我們也希望能通過測(cè)序分析5-formylcytosine (5fC) 和5-carboxylcytosine(5caC)位點(diǎn)，目前我們正在進(jìn)行這方面的研究?！?/SPAN>