Fred Hutchinson癌癥研究中心的研究人員近日發(fā)現(xiàn)了一種新工具，能夠準(zhǔn)確分析與多種疾病和衰老相關(guān)的極罕見線粒體DNA缺失。這項成果在線發(fā)表于《Aging Cell》雜志上。

mtDNA突變的積累與衰老、神經(jīng)肌肉疾病和癌癥有著密切的關(guān)聯(lián)。然而，目前的方法無法準(zhǔn)確定量和鑒定新的缺失事件，因其發(fā)生頻率非常低，正常組織中每1億個線粒體基因組約有一個缺失事件。為了解決這些限制，研究人員開發(fā)出一種基于ddPCR的分析方法，來高分辨率地分析這些罕見缺失。他們將這種方法稱為“數(shù)字缺失檢測（Digital Deletion Detection）”，簡稱3D。

文章的通訊作者Jason Bielas博士談道：“研究mtDNA突變是極其困難的，更不用說缺失。我們的3D檢測在特異性、靈敏度和準(zhǔn)確性上與傳統(tǒng)方法相比有了明顯的改善。微滴式數(shù)字PCR所帶來的通量增加讓分析時間從數(shù)月縮短至數(shù)天。若沒有這一技術(shù)，我們無法獲得這一發(fā)現(xiàn)?！?SPAN lang=EN-US>

Bielas博士指的是Bio-Rad的QX100™ ddPCR系統(tǒng)。利用這一系統(tǒng)，研究小組分析了80億個人類腦mtDNA基因組，并鑒定出超過10萬個帶有缺失的基因組。他們發(fā)現(xiàn)，與流行的看法相反，大多數(shù)mtDNA缺失的增加并不是由新的缺失引起的，而是之前缺失的擴增。他們推測，現(xiàn)有突變的擴增應(yīng)當(dāng)是造成mtDNA缺失積累的主要因素。

3D是一個新穎的三步法過程，包括富集帶有缺失的分子；基因組被分成單分子液滴，并通過ddPCR定量；利用新一代測序確定斷裂點。

富集完成后，通過QX100系統(tǒng)調(diào)整液滴中的分子濃度，讓大多數(shù)液滴不含有突變基因組，而少數(shù)只有一個。這一過程允許每個缺失被無偏向地放大，而不會像qPCR那樣引入誤差。

在擴增后，Bielas及他的小組利用ddPCR確定突變分子的絕對濃度。根據(jù)液滴熒光和擴增子大小之間的關(guān)系，他們能夠鑒定大腦樣品中罕見缺失的大小和復(fù)雜性（到底是幾個克隆的擴增，還是大量隨機缺失）。

研究人員認(rèn)為，3D檢測作為一種重要的新工具，將有助于更好地研究缺失形成和擴增的機制，以及它們在衰老中的作用。而微滴式數(shù)字PCR的高通量和高靈敏度也讓Bielas博士的實驗室能夠靶定骨骼肌、腦組織和血液中其他低水平的致病mtDNA缺失。