來自清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院、哈佛醫(yī)學(xué)院等處的研究人員開發(fā)了一種優(yōu)化的Cas9/sgRNA系統(tǒng)，證實(shí)其能夠有效地應(yīng)用于果蠅進(jìn)行基因編輯，相關(guān)論文發(fā)表在11月4日的《美國科學(xué)院院刊》（PNAS）雜志上。

清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院的倪建泉（Jian-Quan Ni）博士、許江（Jiang Xu，音譯）以及哈佛醫(yī)學(xué)院的Norbert Perrimon博士是這篇論文的共同通訊作者。倪建泉的主要研究方向包括利用第三代轉(zhuǎn)基因敲除技術(shù)構(gòu)建果蠅模式動物平臺；篩選影響消化到免疫和干細(xì)胞的蛋白因子；研究miRNA、ncRNA的功能。

近幾年來，科學(xué)家一直在尋求更加精確的方法對特定的基因進(jìn)行敲除或靶向修飾。通過在基因組水平上進(jìn)行精確的基因編輯，可以更加準(zhǔn)確、更加深入地了解疾病發(fā)病機(jī)理和探究基因功能，找到遺傳性疾病治療的有效手段，因此，基因組編輯具有極其廣泛的發(fā)展前景和應(yīng)用價值。

2011年末，人工核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)被《Nature Methods》雜志評為年度最受關(guān)注的技術(shù)。從當(dāng)年的技術(shù)發(fā)展看，經(jīng)過基因工程改造的核酸酶主要包括3個類型：鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）和歸巢核酸內(nèi)切酶（engineered meganucleases）。目前ZFN以及TALEN已被廣泛應(yīng)用，而歸巢核酸內(nèi)切酶由于改造難度大、成本高，使其應(yīng)用有所局限。近期，細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)CRISPR在人源細(xì)胞染色體修飾上的應(yīng)用使得基因組編輯技術(shù)進(jìn)一步簡化。

CRISPR/Cas是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR被分為三個主要類型，內(nèi)切核酸酶Cas9屬于研究最深入的II型CRISPR/Cas系統(tǒng)。CRISPR/Cas依賴于Cas9，通過單導(dǎo)向RNAs（single- guide RNAs，sgRNAs)可在特定的位點(diǎn)切割DNA。 近期的一些研究證實(shí)這一簡單的Cas9/sgRNA系統(tǒng)可在許多生物中實(shí)現(xiàn)基因組工程操作。

在這篇文章中，研究人員報告了稱開發(fā)了一種高效、廉價、優(yōu)化的Cas9/sgRNA技術(shù)。他們特異性靶向果蠅生殖細(xì)胞生成了可遺傳的突變體等位基因，構(gòu)建出了借助于nanos啟動子、生殖細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)Cas9的轉(zhuǎn)基因果蠅。隨后他們將U6b啟動子控制下、編碼短sgRNAs的質(zhì)粒DNAs注入到這些轉(zhuǎn)基因果蠅體內(nèi)，對果蠅進(jìn)行了基因組DNA編輯。就誘變的效率比較了不同的啟動子和sgRNA支架。通過篩查所有后代中突變后代的數(shù)量，確定這一優(yōu)化系統(tǒng)達(dá)到了74.2%的總誘變率。他們評估了與這種方法相關(guān)的脫靶情況，建立了一個網(wǎng)絡(luò)資源和一個可檢索的、全基因組數(shù)據(jù)庫，可用于預(yù)測果蠅基因組工程操作適當(dāng)?shù)?SPAN lang=EN-US>sgRNAs。最后，研究人員還探討了新方法相比于近期發(fā)表的一些其他方法的優(yōu)勢所在。

研究結(jié)果表明這一優(yōu)化的Cas9/sgRNA系統(tǒng)在果蠅中是高效、特異且廉價的，可以很容易地以半高通量方式投入應(yīng)用。