如何對包涵體蛋白進行表達與復(fù)性?

日期：2023-06-06 13:41:30

包涵體蛋白表達與復(fù)性的過程中，需要進行以下步驟：

一、基因克隆

1、選擇適當?shù)馁|(zhì)粒載體

常見的質(zhì)粒載體有pET系列、pGEX系列等。根據(jù)需要選擇含有不同誘導(dǎo)子和選擇標記的質(zhì)粒載體。

2、擴增目的基因

將目的基因擴增后，將其接入到質(zhì)粒載體的多克隆位點上。這一步可以通過PCR方法來進行擴增，也可以通過化學(xué)合成的方式獲取到序列完整、長度合適的基因片段。同時，在PCR擴增過程中，應(yīng)考慮到靶基因的大小和構(gòu)建的質(zhì)粒載體的限制酶切位點的配對問題。

3、活性測定

在將目的基因接到質(zhì)粒載體后，可進行限制性酶切鑒定、DNA測序鑒定等活性測定，以確定目的基因序列是否正確。

二、轉(zhuǎn)化

將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，使其在細菌內(nèi)表達。轉(zhuǎn)化方法有化學(xué)轉(zhuǎn)化法、電轉(zhuǎn)化法和熱激轉(zhuǎn)化法等。

三、篩選陽性克隆株

轉(zhuǎn)化后需要對大腸桿菌進行篩選。常用的方法是在含有抗生素的LB平板上篩選，含有適合質(zhì)粒載體選擇標記的抗生素（如氨芐青霉素、卡那霉素）。

四、包涵體蛋白表達

1、預(yù)培養(yǎng)

將大腸桿菌陽性克隆株接入到LB培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，通常為37℃、200-250rpm振蕩培養(yǎng)。

2、誘導(dǎo)表達

當大腸桿菌發(fā)展到指定的OD600值時，添加誘導(dǎo)劑進行表達。在此過程中應(yīng)選擇合適的誘導(dǎo)濃度和時間，不同的質(zhì)粒載體可能對誘導(dǎo)劑的反應(yīng)存在差異。

3、加入輔酶

輔酶對于某些蛋白質(zhì)表達至關(guān)重要。如在pET質(zhì)粒中，可以添加輔酶T7。

4、分析表達

通過采集樣品、離心、液氮凍存等方法來分析蛋白表達的情況，如采用SDS-PAGE技術(shù)進行蛋白質(zhì)分離，并采用Western blotting技術(shù)進行檢測。

五、包涵體蛋白復(fù)性

1、包涵體蛋白的裂解

將表達的細菌分裝至每個離心管中，采用超聲波、熱激或流體剪切的方法進行細胞裂解。對于不同類型的包涵體蛋白，應(yīng)選擇不同的裂解方式和時間。

2、去除雜質(zhì)

將細胞裂解物經(jīng)過離心去除細胞碎片等雜質(zhì)，得到含有包涵體的上清液。

3、包涵體蛋白的再溶解

使用緩沖液將包涵體溶解后，使用Refolding Buffer進行復(fù)性。Refolding Buffer通常包括還原劑如DTT等，以促進蛋白的還原和復(fù)性。

4、蛋白純化

復(fù)性過程完成后，使用親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析等方法來純化復(fù)性的蛋白質(zhì)。

通過以上步驟，可以較為可靠地實現(xiàn)包涵體蛋白表達與復(fù)性，并進一步開展相關(guān)實驗研究。