大腸桿菌蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)流程
日期：2023-06-06 13:27:15
大腸桿菌（Escherichia coli）常被用于蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)，因?yàn)槠湟子谂囵B(yǎng)、生長速度快且產(chǎn)量高。本文將介紹一個(gè)常見的大腸桿菌蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)的流程。
一、基因克隆
1、選擇適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體
質(zhì)粒DNA是一個(gè)小型的環(huán)形分子，在基因工程中被廣泛應(yīng)用。選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體對于蛋白表達(dá)非常重要。一般而言，常見的質(zhì)粒載體有pET系列、pGEX系列等。根據(jù)需要選擇含有不同誘導(dǎo)子和選擇標(biāo)記的質(zhì)粒載體。
2、目的基因擴(kuò)增
將目的基因擴(kuò)增后，將其接入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)上。這一步可以通過PCR方法來進(jìn)行擴(kuò)增，也可以通過化學(xué)合成的方式獲取到序列完整、長度合適的基因片段。同時(shí)，在PCR擴(kuò)增過程中，應(yīng)考慮到靶基因的大小和構(gòu)建的質(zhì)粒載體的限制酶切位點(diǎn)的配對問題。
3、活性測定
在將目的基因接到質(zhì)粒載體后，可進(jìn)行限制性酶切鑒定、DNA測序鑒定等活性測定，以確定目的基因序列是否正確。
二、轉(zhuǎn)化
將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，使其在細(xì)菌內(nèi)表達(dá)。轉(zhuǎn)化方法有化學(xué)轉(zhuǎn)化法、電轉(zhuǎn)化法和熱激轉(zhuǎn)化法等。
三、篩選陽性克隆株
轉(zhuǎn)化后需要對大腸桿菌進(jìn)行篩選。常用的方法是在含有抗生素的LB平板上篩選，含有適合質(zhì)粒載體選擇標(biāo)記的抗生素。
四、蛋白表達(dá)
1、預(yù)培養(yǎng)
將大腸桿菌陽性克隆株接入到LB培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，通常為37℃、200-250rpm振蕩培養(yǎng)。
2、誘導(dǎo)表達(dá)
當(dāng)大腸桿菌發(fā)展到指定的OD600值時(shí)，添加誘導(dǎo)劑進(jìn)行表達(dá)。在此過程中應(yīng)選擇合適的誘導(dǎo)濃度和時(shí)間，不同的質(zhì)粒載體可能對誘導(dǎo)劑的反應(yīng)存在差異。
3、加入輔酶
輔酶對于某些蛋白質(zhì)表達(dá)至關(guān)重要。如在pET質(zhì)粒中，可以添加輔酶T7。
4、分析蛋白表達(dá)
通過采集樣品、離心、液氮凍存等方法來分析蛋白表達(dá)的情況，如采用SDS-PAGE技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，并采用Western blotting技術(shù)進(jìn)行檢測。
五、提取純化
1、細(xì)胞破碎
為了提取表達(dá)的蛋白質(zhì)，需要對細(xì)胞進(jìn)行破碎。一般使用化學(xué)破碎法、超聲波法、高壓法等方法將細(xì)胞破碎。
2、純化
破碎后的混合物中含有多種蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，需要進(jìn)行純化。常見的純化方法有親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析等。
通過以上流程，大腸桿菌中的目的基因可以得到表達(dá)，并且通過適當(dāng)?shù)募兓椒?，可以提取高純度的目的蛋白質(zhì)。
