SMN1基因蛋白過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建實(shí)驗(yàn)流程
日期：2023-06-14 13:46:05
一、SMN1基因簡介
脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）是一種常見的肌肉萎縮疾病，主要由于SMN1 （survival of motor neuron 1）基因的表達(dá)缺陷引起。SMN1基因編碼一個名為survival of motor neuron (SMN)的蛋白，它是一個與細(xì)胞核中的前體RNA加工密切相關(guān)的蛋白。
SMN蛋白含有一個高度保守的復(fù)合物，稱為SMN復(fù)合物（SMN complex）。SMN復(fù)合物在RNA剪接和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用，并且在神經(jīng)元運(yùn)輸過程中也扮演重要角色。SMN1基因突變或缺失導(dǎo)致SMN蛋白量大幅降低，從而導(dǎo)致SMA的發(fā)生。
二、SMN1基因蛋白過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
通過構(gòu)建含有SMN1基因的過表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染到目標(biāo)細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)SMN1抗體蛋白的過量表達(dá)。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：
（1）采用PCR技術(shù)從人類基因組DNA中擴(kuò)增出SMN1全長序列。
（2）構(gòu)建SMN1基因的克隆體，插入到適合于目標(biāo)細(xì)胞中表達(dá)的質(zhì)粒載體中。為了方便檢測和分選，可以將SMN1基因與熒光蛋白等標(biāo)記基因連成一體。
（3）將質(zhì)粒DNA經(jīng)過限制性內(nèi)切酶切割和PCR檢測后，純化出大量的目的質(zhì)粒。
（4）將純化得到的質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)移到目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)。
（5）檢測并驗(yàn)證SMN1蛋白過表達(dá)的效果，可以通過Western blot、免疫熒光等方式進(jìn)行驗(yàn)證。
2、實(shí)驗(yàn)步驟
（1）擴(kuò)增SMN1基因全長序列
使用人類基因組DNA作模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增SMN1基因全長序列。選擇引物時建議能夠擴(kuò)增出完整的SMN1序列，并且在5’端和3’端加入適當(dāng)?shù)南拗菩阅┒诵蛄蟹奖愫罄m(xù)克隆處理。PCR反應(yīng)方案如下：
| 成分 | 體積/重量 |
| TAE buffer | 10 ul |
| dNTPs (10 mM) | 1 ul |
| Forward primer (10 uM) | 0.5 ul |
| Reverse primer (10 uM) | 0.5 ul |
| Template DNA | 50 ng |
| Taq polymerase (5u/ul) | 0.25 ul |
| ddH2O | 100 ul |
PCR條件如下：
| 步驟 | 溫度 | 時間 |
| 初始變性 | 94°C | 5 min |
|
循環(huán)擴(kuò)增
|
94°C | 30 s |
| 56°C | 30 s | |
| 72°C | 1 min/kbp | |
| 最終延伸 | 72°C | 10 min |
| 保持 | 4°C | ∞ |
（2）構(gòu)建SMN1基因的克隆體并插入質(zhì)粒載體中
將擴(kuò)增出的SMN1基因與合適的質(zhì)粒載體進(jìn)行雙酶切，并進(jìn)行連接處理，得到含有SMN1全長序列的表達(dá)質(zhì)粒。為了方便轉(zhuǎn)染和檢測，可以選擇帶有熒光標(biāo)記的質(zhì)粒載體（例如pEGFP-C1）。實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：
a. 雙酶切
將SMN1 PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體使用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，以便插入SMN1 DNA序列，其中使用的RE如下：
SMN1：EcoRI和BamHI
質(zhì)粒載體：EcoRI和BamHI
b. 連接
將SMN1PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體使用T4 DNA ligase聯(lián)接，形成含有SMN1基因的過表達(dá)質(zhì)粒。
c. 轉(zhuǎn)染
將得到的質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)移到目標(biāo)細(xì)胞中。
（3）檢測SMN1蛋白的過表達(dá)效果
通過Western blot、免疫熒光等方式來檢測SMN1蛋白的過表達(dá)效果。
a. Western blot
取適量的細(xì)胞，進(jìn)行SDS-PAGE和電轉(zhuǎn)印，然后進(jìn)行Western blot分析。使用SMN1抗體和熒光二抗探測SMN1蛋白的表達(dá)程度。
b. 免疫熒光
選擇合適的抗SMN1抗體和熒光二抗，利用熒光顯微鏡觀察表達(dá)SMN1的細(xì)胞。
三、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)
PCR反應(yīng)條件需要根據(jù)引物設(shè)計(jì)和DNA模板質(zhì)量進(jìn)行優(yōu)化，以獲得高效率和特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
選取合適的質(zhì)粒載體便于表達(dá)和檢測，同時確保質(zhì)粒對目標(biāo)細(xì)胞有較高的轉(zhuǎn)染效率。
實(shí)驗(yàn)前充分準(zhǔn)備好瓶蓋、移液器、孵育箱等操作工具，并嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。
轉(zhuǎn)染處理時，要注意選取合適的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染條件，避免不必要的細(xì)胞毒性。
在實(shí)驗(yàn)過程中要注意安全，避免接觸實(shí)驗(yàn)物質(zhì)及其溶液或制品，避免刺傷或感染。
