實驗技術|蛋白免疫印跡WB（下）

日期：2019-03-27 09:38:53

科研就像賽跑，你比別人跑的快，就比別人多發(fā)幾篇SCI~

前兩期，給朋友們帶來了

實驗技術|蛋白免疫印跡WB（上）

實驗技術|蛋白免疫印跡WB（中）

做了很久的WB，走了很多彎路，但是WB想要做好并不難，總結WB實驗中可能會遇到的問題，分析可能的原因及對應的解決方案，才是實驗成功的基石。

蛋白免疫印跡（WB）是基于抗原抗體的特異性結合作用，以檢測復雜樣品中的某種蛋白，并對其進行半定量分析的一種方法。

主要用于靶標蛋白特異性表達的定性或半定量分析，蛋白與蛋白或蛋白與DNA相互作用的后續(xù)分析，以及蛋白修飾的鑒定分析。

常見問題分析

1.為什么我的細胞提取液中沒有檢測到目的蛋白？

原因有很多：

a) 細胞中不表達這種蛋白質，換一種細胞；

b) 細胞中的蛋白質被降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性；

c) 抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，是否有問題；

d) 酶降解可能是沒有保持低溫操作，樣品保存不當，樣品放置時間過長。

2.我做的蛋白質分子量很?。?0 kDa），請問怎么做WB？

a)可以選擇PSQ膜，同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉移。其他按步驟即可；

b)也可選擇孔徑0.22 μm的PVDF膜或者NC膜，轉膜時間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系。

3.我的目的帶很弱，如何加強？

a)可以加大抗原上樣量，這是最主要的；

b)也可以將一抗稀釋比例降低；

c)還可以延長曝光時間。

4.DAB好還是ECL好？

DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；

ECL結果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。

5.膠片是一片空白，是怎么回事？

如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。

a) 二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；

b) ECM底物中H₂O₂，不穩(wěn)定，失活；

c) ECL底物沒覆蓋到相應位置；

d) 一抗選擇不當二抗失活；

e) 二抗失活。

6.磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等？

NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。

7.細胞水平要做WB，多少細胞提的蛋白夠做WB？

一般5×10^6就足夠。

8.如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？

可以濃縮樣品，也可以根據(jù)目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5 mm的。

9.大分子量蛋白200 kDa，在做WB要注意什么？

a) 做200kDa蛋白的WB時要注意，分離膠最好選擇>7%的；剝膠時要小心；

b) 轉移時間需要相應延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。

c) 轉膜液中甲醇含量可適當降低，推薦使用濕裝轉膜效率更高哦!

10.免疫組化和WB可以用同一種抗體嗎？

免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空間結構限制，煮后變性會消失。如果所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和WB，而如果抗體識別構象形表位，則只能用于免疫組化。

11.WB中抗體的可以重復應用嗎？

抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴，可反復使用2－3次。稀釋后應在2－3天內(nèi)使用，4℃保存，避免反復凍融。

12.上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達到最佳效果？

無特殊要求。但一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復使用過一兩次的緩沖液。

原因分析及解決辦法