Mesothelin：癌癥免疫治療的后起之秀
日期：2019-09-24 14:14:17
間皮素（Mesothelin）又被稱為MSLN，它是由MSLN基因編碼的一種細(xì)胞表面糖蛋白。MSLN基因編碼一種前蛋白，經(jīng)蛋白水解后產(chǎn)生巨核細(xì)胞增強(qiáng)因子（megakaryocyte-potentiating factor，MPF）和間皮素兩種蛋白產(chǎn)物。巨核細(xì)胞增強(qiáng)因子是一種能夠刺激骨髓巨核細(xì)胞集落形成的細(xì)胞因子。間皮素是通過糖基磷脂酰肌醇錨定在細(xì)胞表面的蛋白。
間皮素是一種存在于正常間皮細(xì)胞上的分化抗原。在正常組織中很少表達(dá)，但是在間皮瘤、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤中均有高表達(dá)[1]，因此間皮素有可能成為癌癥治療的重要靶點(diǎn)。
1. 間皮素的發(fā)現(xiàn)
該蛋白首先由其與單克隆抗體K1[2]的反應(yīng)活性被鑒定。間皮素能被單克隆抗體K1特異性識(shí)別。Chang等人從能與單克隆抗體K1發(fā)生反應(yīng)的海拉(hela)細(xì)胞系的基因文庫(kù)中提取互補(bǔ)DNA克隆出間皮素基因。之所以將其命名為間皮素，因該基因編碼產(chǎn)生的膜結(jié)合蛋白主要位于正常間皮細(xì)胞表面。
2. 間皮素結(jié)構(gòu)特征
間皮素基因位于染色體16 p13.3，其基因全長(zhǎng)8 kb，cDNA大小為213 bp，含有1884 bp的開放閱讀框，17個(gè)外顯子，編碼628個(gè)氨基酸。MSLN基因編碼一個(gè)71 KD的前體蛋白。該前體蛋白被弗林（furin）蛋白酶水解為兩個(gè)部分：一個(gè)可溶性31 kD N端蛋白稱為巨核細(xì)胞增強(qiáng)因子（megakaryocyte-potentiating factor，MPF）和一個(gè)40 kD膜結(jié)合片段稱為MSLN [3]。
圖1間皮素的成熟過程
目前認(rèn)為間皮素至少存在3個(gè)異構(gòu)體，其中膜結(jié)合的間皮素是最常見的間皮素的變體；間皮素V-1具有額外的8個(gè)氨基酸，并且它也是與膜結(jié)合的形式；間皮素V-2具有修飾的COOH末端，是間皮素在蛋白酶的作用下水解，然后從細(xì)胞表面脫落而成，稱為可溶性間皮素相關(guān)肽（soluble mesothelin-related peptide，SMRP）[4]。
圖2 間皮素的異構(gòu)體
2.1 可溶性間皮素
間皮素的可溶形式是在氨基酸的600位刪除COOH-末端與膜結(jié)合的氨基酸發(fā)生移碼突變和轉(zhuǎn)錄過早終止而造成異常接合，影響間皮素與細(xì)胞膜的聯(lián)接。可溶性間皮素蛋白大小一般為42-45 kDa，其NH2-末端的氨基酸序列與膜結(jié)合間皮素相同。可溶性的間皮素的來源可能是膜結(jié)合間皮素的蛋白水解產(chǎn)物，也可能是通過可變剪接得到的。可溶性間皮素可以在一些間皮素陽性腫瘤患者的血中檢測(cè)到，測(cè)定血中的間皮素可用于某些疾病的診斷。
3. 間皮素的表達(dá)
間皮素可表達(dá)于正常胸膜、心包和腹膜的間皮細(xì)胞中，它在氣管，卵巢，睪丸，扁桃體和輸卵管的上皮細(xì)胞表面上表達(dá)最低。此外，作為與腫瘤侵襲有關(guān)的細(xì)胞表面抗原，它還在多種腫瘤組織中高表達(dá)，主要包括間皮瘤、卵巢和胰腺腺癌等。
3.1 間皮素在惡性腫瘤中的表達(dá)
MSLN被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中過度表達(dá)。目前在間皮瘤、卵巢癌、肺癌，食道癌，胰腺癌[5]，胃癌，膽管癌，子宮內(nèi)膜癌，胸腺癌，結(jié)腸癌和乳腺癌中均觀察到間皮素的過表達(dá)。
隨腫瘤亞型的不同，MSLN表達(dá)的頻率和分布而不同。
MSLN被發(fā)現(xiàn)表達(dá)在90％的上皮樣惡性胸膜間皮瘤，69％的肺腺癌，60％的乳腺癌和46％的食管癌中[6]。
在癌細(xì)胞內(nèi)，MSLN的表達(dá)可能是在腔/膜或細(xì)胞質(zhì)。不同類型的腫瘤MSLN的表達(dá)位置也有一定的差異。在間皮瘤腫瘤中，MSLN表達(dá)在細(xì)胞表面，呈均勻分布。在肺腺癌中，MSLN在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞表面均有表達(dá)。在胃癌中，細(xì)胞質(zhì)表達(dá)比膜表達(dá)更為普遍。
MSLN還在甲狀腺、腎臟和滑膜肉瘤腫瘤等實(shí)體腫瘤中表達(dá)。
4. 間皮素的生物學(xué)功能
研究人員曾對(duì)MSLN基因敲除的小鼠進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這些基因敲除小鼠表現(xiàn)出正常的發(fā)育、繁殖和血細(xì)胞計(jì)數(shù)[7]。這說明間皮素并非小鼠正常生長(zhǎng)發(fā)育繁殖所必需。也正因?yàn)槿绱?，到目前為止，間皮素的生物學(xué)功能目前仍不清楚。
有研究表明間皮素可能在粘附中發(fā)揮作用。隨著人們對(duì)腫瘤中間皮素的研究越來越深入，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。MSLN的過表達(dá)可激活NF-κB，MAPK和PI3K通路，并通過誘導(dǎo)MMP7和MMP9的激活和表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或促進(jìn)細(xì)胞增殖，遷移和轉(zhuǎn)移。
MSLN異常表達(dá)在腫瘤細(xì)胞增殖、黏附及耐藥性方面起著重要作用。
圖3 間皮素的生物學(xué)功能
4.1 細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期
在胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，間皮素可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。沉默胰腺癌腫瘤細(xì)胞中的間皮素基因可以抑制增殖。間皮素可以通過減緩細(xì)胞進(jìn)入S期而抑制細(xì)胞周期[8]。間皮素的超量表達(dá)則會(huì)持續(xù)激活NF-κB信號(hào)通路并產(chǎn)生高水平的IL-6，從而激活轉(zhuǎn)錄蛋白Stat3，導(dǎo)致與細(xì)胞周期相關(guān)的cyclin E和周期蛋白依賴激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）的表達(dá)量增高。這最終加速了細(xì)胞從G1期到S期的轉(zhuǎn)變。
4.2 細(xì)胞黏附和轉(zhuǎn)移
研究表明，轉(zhuǎn)染了間皮素的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞3T3與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，前者與培養(yǎng)皿附著更牢固、更難從細(xì)胞表面清除，這表明間皮素可能與細(xì)胞黏附有關(guān)。Rump等[9]在卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)，MSLN與CA125的高親和力相互作用導(dǎo)致細(xì)胞間的異型黏附，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移。MSLN的表達(dá)以及血清SMRP水平的升高與腫瘤的進(jìn)展、分期的增加以及總體生存率的降低有關(guān)。
4.3 細(xì)胞耐藥
間皮素可以增加癌細(xì)胞對(duì)藥物的耐受性[10] [11]。
研究表明，間皮素的表達(dá)在卵巢癌化療敏感與耐藥患者中存在差異，在耐藥患者中間皮素表達(dá)顯著升高。下調(diào)間皮素表達(dá)后，卵巢癌耐藥細(xì)胞株的化療敏感性也明顯提高，在一定程度上逆轉(zhuǎn)了細(xì)胞耐藥。
研究發(fā)現(xiàn)，間皮素可能通過同時(shí)激活PI3K/AKT和MAPK/ERK兩個(gè)通路，阻斷了紫杉醇誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡。這是間皮素所引起的細(xì)胞耐藥的原因之一。 間皮素基因可能受到Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子的調(diào)節(jié)[12]。在卵巢癌和胰腺癌等Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑持續(xù)激活的腫瘤，間皮素表達(dá)水平增高。
5. 間皮素的應(yīng)用
5.1 腫瘤治療的疫苗
間皮素是一種具有強(qiáng)烈免疫原性的蛋白質(zhì)，因此可用于制作抗腫瘤疫苗。 CRS-207是Aduro公司開發(fā)的一款以李斯特菌為載體的腫瘤疫苗，其作用機(jī)制是巨噬細(xì)胞將入侵細(xì)菌吞噬內(nèi)化加工處理，將間皮素抗原呈遞給T細(xì)胞，釋放淋巴因子，激活殺傷性T細(xì)胞靶向間皮素，最終引起表達(dá)間皮素的腫瘤細(xì)胞凋亡。
5.2 腫瘤診斷標(biāo)志物
可溶性間皮素可在實(shí)體腫瘤患者血清中檢測(cè)到，這使其成為表達(dá)間皮素的腫瘤有價(jià)值的診斷工具。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）可用于檢測(cè)血漿可溶性間皮素。可溶性間皮素自身缺乏敏感性及特異性，但與CA125聯(lián)合檢測(cè)可提高診斷效率[13]。間皮素結(jié)合其他卵巢腫瘤標(biāo)志物可應(yīng)用于卵巢癌的篩查。
5.3 腫瘤特異性免疫治療的靶點(diǎn)
鑒于間皮素在多種人類惡性腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)，在正常組織中很少表達(dá)，因而間皮素有望用于腫瘤特異性治療的靶點(diǎn)。目前針對(duì)MSLN設(shè)計(jì)了各種免疫治療策略，主要包括基于抗體療法和CAR-T的藥物的設(shè)計(jì)。
迄今報(bào)道的MSLN靶向免疫治療具有良好的安全性[14] [15]。MSLN是許多常見實(shí)體腫瘤中潛在的CAR靶點(diǎn)。
5.3.1 抗體類藥物
抗體類藥物主要通過抗體中和、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用(ADCP)、抗體與效應(yīng)分子(毒素或抑制劑)結(jié)合等方式來介導(dǎo)細(xì)胞凋亡或抑制細(xì)胞增殖，靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。
matuximab（MORAb-009）是一種嵌合抗體，由抗間皮素抗體SS1單鏈可變區(qū)片段與人IgG1/κ恒定區(qū)組成，通過抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）殺傷腫瘤細(xì)胞，并可阻斷間皮素與CA125的相互作用[16]。
Anetumab Ravtansine (BAY94-9343)是一種抗體偶聯(lián)藥物，由抗間皮素抗體與美登素衍生物DM4（微管蛋白聚合酶抑制劑）組成[17]。BAY94-9343通過抗間皮素抗體與腫瘤細(xì)胞表面間皮素結(jié)合后，可被內(nèi)化進(jìn)入溶酶體然后釋放DM4殺傷腫瘤細(xì)胞。
DMOT4039A是由人源化IgG1抗間皮素單克隆抗體h7D9 v3（α-MSLN）與抗微管蛋白藥物monomethyl auristatin E（MMAE）通過二肽連接而成的抗體偶聯(lián)藥物。DMOT4039A主要通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入溶酶體并釋放出MMAE，隨后與細(xì)胞質(zhì)的微管蛋白結(jié)合從而阻滯細(xì)胞周期的G2/M期，使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯、誘導(dǎo)凋亡。
MDX-1204是由全人源間皮素抗體（MDX-1383）與一種烷化劑duocarmycin（MED2460）偶聯(lián)而成的抗體偶聯(lián)藥物[18]。MDX-1204與間皮素的結(jié)合阻斷其與CA125之間的相互作用。MDX-1204與間皮素結(jié)合后被細(xì)胞內(nèi)化并釋放出小分子藥物MED2460，MED2460通過與DNA小溝結(jié)合，引起DNA不可逆烷基化，進(jìn)而破壞核酸結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
- Amatuximab
- Anetumab Ravtansine
- DMOT4039A
- MDX-1204
5.3.2 免疫毒素
SS1P是重組免疫毒素，它是由小鼠抗間皮素抗體的可變區(qū)片段與假單胞菌外毒素38（PE38）融合而成[19]。SS1(dsFv)PE38是一種重組的抗間皮素免疫毒素，目前正在對(duì)間皮素表達(dá)腫瘤患者進(jìn)行臨床評(píng)估。許多基于MSLN抗體SS1或其他改良和人性化版本的藥物已被開發(fā)用于靶向治療。
5.3.3 嵌合抗原受體T細(xì)胞療法
嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR）通常由細(xì)胞外抗原識(shí)別域(通常由抗體的單鏈可變片段(single chain variable fragment, scFv)衍生而來)、作為細(xì)胞質(zhì)膜錨定的跨膜域和傳遞T細(xì)胞活化信號(hào)的細(xì)胞內(nèi)域組成。
圖4 嵌合抗原受體的結(jié)構(gòu)
第一代CAR只包含一個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域，通常是CD3ζ鏈，這足以啟動(dòng)T細(xì)胞活化，但只產(chǎn)生短期增殖活性和低水平的細(xì)胞毒性。
第二代CAR通過加入另一種共刺激分子(CD28、4-1BB或OX40)大大提高了效能。
第三代CAR含有兩個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域（CD28，4-1BB，TLR2或DAP10）和鉸鏈結(jié)構(gòu)域，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性、持久性和腫瘤抑制效果方面更優(yōu)。
第四代CAR，可以分泌細(xì)胞因子或其他效應(yīng)分子，如IL-12，IL-15，IL-7或CCL19，以調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境。
關(guān)于CAR-T的詳細(xì)信息，這篇文章有更為詳細(xì)的介紹：細(xì)胞免疫治療-CAR-T細(xì)胞療法。
圖5 MSLN CAR的改進(jìn)
間皮素CAR-T細(xì)胞治療在間皮瘤、卵巢癌、肺癌小鼠移植模型中取得了令人鼓舞的結(jié)果，相應(yīng)的一些臨床試驗(yàn)也已獲批，目前正在進(jìn)行中[20] [21]。
提高CAR-T細(xì)胞的效率，是CAR-T療法中的主要問題之一。這主要需要從以下幾個(gè)方面著手：
促進(jìn)CAR-T細(xì)胞浸潤(rùn)；
增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的功能持久性；
增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞以克服腫瘤微環(huán)境中遇到的抑制信號(hào)；
通過預(yù)防靶向/非腫瘤毒性來提高安全性。
將MSLN CAR-T細(xì)胞設(shè)計(jì)成過度表達(dá)趨化因子受體CCR2B被證明可增強(qiáng)T細(xì)胞向?qū)嶓w腫瘤的轉(zhuǎn)運(yùn)。因?yàn)殚g皮瘤細(xì)胞高度表達(dá)其趨化因子配體CCL2，而T細(xì)胞僅表達(dá)少量CCR2B。CCR2B過表達(dá)顯著提高了系統(tǒng)給藥的治療效率。
為鼎力協(xié)助科研和藥企人員針對(duì)Mesothelin（MSLN）的在腫瘤中的臨床應(yīng)用研究，CUSABIO推出MSLN活性蛋白（Code：CSB-MP015044HUc9），助力您在MSLN機(jī)制方面的研究或其潛在臨床價(jià)值的探索。
華美 CUSABIO MSLN 蛋白
Recombinant Human Mesothelin (MSLN), partial (Active) Code: CSB-MP015044HUc9
by SDS-PAGE
The high purity is greater than 95% as determined by SDS-PAGE.
Immobilized MSLN at 2 μg/ml can bind Anti-MSLN rabbit monoclonal antibody. The EC50 of the MSLN protein is 2.657-3.177 ng/ml.
Immobilized MUC16 (CSB-MP704410HU3c7) at 10 μg/ml can bind MSLN. The EC50 is 460.7-662.2 ng/ml.
參考文獻(xiàn)：
[1] Paolo B, Sara C. Amatuximab and novel agents targeting mesothelin for solid tumors [J]. OncoTargets and Therapy, 2017, Volume 10: 5337-5353.
[2] Chang K. Characterization of the antigen (CAK1) recognized by monoclonal antibody K1 present on ovarian cancers and normal mesothelium [J]. Cancer Res, 1992, 52(1): 181-186.
[3] Manzanares M, Campbell D J W, Maldonado G T, et al. Overexpression of periostin and distinct mesothelin forms predict malignant progression in a rat cholangiocarcinoma model [J]. Hepatol Commun, 2018, 2(2): 155-172.
[4] Burt B M, Lee H S, Rosen V L D, et al. Soluble Mesothelin-Related Peptides to Monitor Recurrence After Resection of Pleural Mesothelioma [J]. Annals of Thoracic Surgery, 2017, 104(5): 1679.
[5] Argani P. Mesothelin is overexpressed in the vast majority of ductal adenocarcinomas of the pancreas: Identification of a new pancreatic cancer marker by serial analysis of gene expression (SAGE) [J]. Clin Cancer Res, 2001, 7.
[6] Morello A, Sadelain M, Adusumilli P S. Mesothelin-Targeted CARs: Driving T cells to Solid Tumors [J]. Cancer Discovery, 2015, 6(2).
[7] Bera T K, Pastan I. Mesothelin Is Not Required for Normal Mouse Development or Reproduction [J]. Molecular and Cellular Biology, 2000, 20(8): 2902-2906.
[8] Guadalupe A M, Beate P, Calderón-Aranda Emma S, et al. Biomarkers for Predicting Malignant Pleural Mesothelioma in a Mexican Population [J]. International Journal of Medical Sciences, 2018, 15(9): 883-891.
[9] Rump A, Morikawa Y, Tanaka M, et al. Binding of Ovarian Cancer Antigen CA125/MUC16 to Mesothelin Mediates Cell Adhesion [J]. Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(10): 9190-9198.
[10] Bharadwaj U, Marin-Muller C, Li M, et al. Mesothelin confers pancreatic cancer cell resistance to TNF-α-induced apoptosis through Akt/PI3K/NF-κB activation and IL-6/Mcl-1 overexpression [J]. Molecular Cancer, 2011, 10(1): 106.
[11] Cheng W F, Huang C Y, Chang M C, et al. High mesothelin correlates with chemoresistance and poor survival in epithelial ovarian carcinoma [J]. BRITISH JOURNAL OF CANCER, 2009, 100(7): 1144-1153.
[12] Moon R T, Prieve M G. Stromelysin-1 and mesothelin are differentially regulated by Wnt-5a and Wnt-1 in C57mg mouse mammary epithelial cells [J]. BMC Developmental Biology, 2003, 3(1): 1-10.
[13] Bast R C. Status of tumor markers in ovarian cancer screening [J]. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology, 2003, 21(10 Suppl): 200s.
[14] Villena-Vargas J, Adusumilli P S. Mesothelin-targeted immunotherapies for malignant pleural mesothelioma [J]. Annals of Cardiothoracic Surgery, 2012, 1(4): 466.
[15] Pastan I, Hassan R. Discovery of Mesothelin and Exploiting It as a Target for Immunotherapy [J]. Cancer Research, 2014, 74(11): 2907-2912.
[16] Hassan R, Ebel W, Routhier E L, et al. Preclinical evaluation of MORAb-009, a chimeric antibody targeting tumor-associated mesothelin [J]. Cancer Immunity, 2007, 7: 20.
[17] Grosso F, Scagliotti G V. Systemic treatment of malignant pleural mesothelioma [J]. Future Oncology, 2012, 8(3): 293-305.
[18] Pogue S, Chen X, Alexander S, et al. Fully human antimesothelin antibody drug conjugate demonstrates antitumor effects in human lung cancer models [J]. Clinical Cancer Research, 2008, 14(15 Supplement): A13-A13.
[19] Kolyvas E, Rudloff M, Poruchynsky M, et al. Mesothelin-targeted immunotoxin RG7787 has synergistic anti-tumor activity when combined with taxanes [J]. Oncotarget, 2017, 8(6): 9189.
[20] Beatty GL, Haas AR, Maus MV, et al. Mesothelin-Specific Chimeric Antigen Receptor mRNA-Engineered T Cells Induce Antitumor Activity in Solid Malignancies [J]. Cancer Immunology Research, 2015, 3(2): 217.
[21] Adusumilli P S, Cherkassky L, Villena-Vargas J, et al. Regional delivery of mesothelin-targeted CAR T cell therapy generates potent and long-lasting CD4-dependent tumor immunity [J]. Science Translational Medicine, 2014, 6(261): 261ra151-261ra151.
