超越干細胞，癌癥研究新風(fēng)向，為何它能開啟精準醫(yī)學(xué)新時代？
日期：2020-12-18 14:06:05
在和癌癥斗爭的歷史里，人類做過無數(shù)次的嘗試，從小分子研究，到大分子核酸、多樣性蛋白，再到細胞治療，從未停歇腳步。而干細胞的出現(xiàn)極大地推動了再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，涵蓋了基于細胞的高通量藥物篩選、細胞移植和器官移植等應(yīng)用領(lǐng)域，展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景。
而醫(yī)學(xué)界近幾年最熱門的研究——外泌體，作為介于分子和細胞之間的微小結(jié)構(gòu)，原以為是干細胞所代謝出的廢棄物，經(jīng)多年研究卻發(fā)現(xiàn)它在治療疾病、修復(fù)身體機能上占有不可缺席的地位！源自于干細胞的外泌體也成為了關(guān)注的熱點，為疾病的診斷和治療帶來了新思路。
外泌體用途比干細胞更廣，關(guān)鍵在于：不會被身體排斥。
Oncogene十月刊發(fā)了膀胱癌中MSC衍生的外泌體miR-139-5p功能的研究。
microRNA可以通過間充質(zhì)干細胞（MSC）衍生的外泌體傳遞至腫瘤細胞，發(fā)揮其功能。RNA定量檢測發(fā)現(xiàn)復(fù)合物PRC1（polycomb repressor complex 1）在膀胱癌中表達上調(diào)，體外實驗證實PRC1沉默阻礙腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實PRC1受miR-139-5p的調(diào)控。接下來，將膀胱癌細胞與從過表達miR-139-5p的人臍帶間充質(zhì)干細胞（hUCMSCs）中分離出來的外泌體共培養(yǎng)，來自hUCMSCs的外泌體的miR-139-5p可以轉(zhuǎn)移到膀胱癌細胞中，下調(diào)PRC1的表達。此外，體內(nèi)體外實驗均證實hUCMSCs衍生的外泌體miR-139-5p具有抑制膀胱癌發(fā)展的作用。這一結(jié)果突顯了利用MSC衍生的外泌體miR-139-5p治療膀胱癌是一種有前景的治療策略。
2013年，外泌體因諾貝爾醫(yī)學(xué)獎而被眾人知曉，也因此將外泌體研究推向了前所未有的新高潮。外泌體在體液中廣泛存在及易獲得性等特點被譽為液體活檢"新秀"，成為疾病的精確診斷和治療研究的熱點。
外泌體是什么
外泌體（Exosomes）是一種能被機體內(nèi)大多數(shù)細胞分泌的直徑大約為30-150 nm 的具有脂質(zhì)雙層膜的微小膜泡，它廣泛存在并分布于血清、血漿、唾液、尿液、腦脊液和乳液等多種體液中。
外泌體攜帶和傳遞重要的信號分子，包含細胞溶質(zhì)蛋白、 參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白、各種代謝酶、熱休克蛋白和四跨膜蛋白及特殊蛋白質(zhì)，參與細胞活動的重要調(diào)控，形成了一種全新的細胞間信息傳遞系統(tǒng)，影響細胞的生理狀態(tài)并與多種疾病的發(fā)生與進程密切相關(guān)。
外泌體的表面marker主要有CD9、CD63、CD81、PKM、ENO1、TSG101、熱休克蛋白家族等。其中脂質(zhì)雙分子層中含有豐富的Phosphatidylserine。
▲圖片來源：Exosomes:Fundamental Biology and Roles in Cardiovascular Physiology
外泌體投資熱潮涌現(xiàn)
作為液體活檢領(lǐng)域的"三大標(biāo)桿"之一，外泌體被認為是細胞間通訊、疾病診斷和預(yù)后循環(huán)生物標(biāo)志物的重要載體，外泌體通過其攜帶的脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)、miRNA等來調(diào)節(jié)受體細胞的生物學(xué)活性，從而參與機體免疫應(yīng)答、細胞遷移、腫瘤侵襲、抗原提呈等生物學(xué)過程。大量的證據(jù)表明外泌體及其內(nèi)容物具有成為新型診斷標(biāo)志物的潛能，在臨床和治療方面展現(xiàn)出了極具前景的研究價值。
在學(xué)術(shù)研究方面，國家自然基金項目查詢所示：近10年，外泌體相關(guān)項目數(shù)量從500上升到了接近2000個（數(shù)量上增加了近4倍）；資助金額增長了近6倍。2019年的外泌體相關(guān)的國家自然科學(xué)基金中標(biāo)總計已達2.13億元，較2018年1.69億元增長26%，2018較2017年1.23億元增長37%。
外泌體受到越來越多的關(guān)注，涌現(xiàn)了大批的外泌體相關(guān)研究課題，以迅雷不及掩耳之勢火了起來。
而在資本的助力下，外泌體在治療和診斷方向的應(yīng)用也從實驗室的研究階段迅速推進，迎來了產(chǎn)業(yè)化合作新浪潮，成為下一個群雄角逐的黃金賽場。外泌體產(chǎn)業(yè)在歐美日已蓬勃發(fā)展，迄今為止，全球約有40多家外泌體治療和診斷的公司。
▲外泌體公司列表
Codiak BioSciences作為投資者的寵兒，2019年1月，生物制藥公司Jazz Pharmaceuticals和Codiak BioSciences宣布價值10億美元的戰(zhàn)略合作，共同研究、開發(fā)和商業(yè)化工程外泌體，為難以治療的癌癥創(chuàng)建外泌體療法。
2020年6月份，禮來、武田、拜耳宣布了與外泌體公司高達20億美元的交易。其中，禮來與英國Evox Therapeutics 簽署了一項價值 12 億美元的合作協(xié)議，未來雙方將利用Evox專有的外泌體藥物遞送平臺，開發(fā)RNA干擾和反義寡核苷酸藥物有效遞送載體，用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。
外泌體最新研究進展
外泌體從發(fā)現(xiàn)至今已有30多年的歷史，雖然最初被認為可能是細胞的“垃圾”，所以才被排出來，但是近年來研究表明外泌體具有功能活性并可進行細胞間信息傳遞。作為信號分子的載體，外泌體在生物體內(nèi)介導(dǎo)多個核心生物過程，包括免疫監(jiān)視、炎癥抑制反應(yīng)、干細胞未分化狀態(tài)的維持與可塑性、鄰近和遠端細胞的增殖與凋亡抑制等。
白癜風(fēng)是由自體表皮黑色素細胞的逐步破壞引起的皮膚脫色疾病。適應(yīng)性免疫中CD8+、Treg和Th17細胞失衡為特征的自身免疫性不耐受被認為是造成白癜風(fēng)中黑色素細胞破壞的主要原因。Autoimmun Rev 9月刊的一篇文章調(diào)查了外泌體與白癜風(fēng)的關(guān)聯(lián)，強調(diào)了外泌體的免疫調(diào)節(jié)作用。在病理和生理條件下，外泌體途徑對于調(diào)節(jié)CD8+，Treg和Th17細胞都是必需的。在病理條件下，分泌的外泌體可影響疾病微環(huán)境中CD8+，Treg和Th17細胞的平衡，環(huán)境失衡可能破壞自身免疫耐受，導(dǎo)致白癜風(fēng)。另外，外泌體在黑色素生成途徑中，充當(dāng)角質(zhì)形成細胞和黑色素細胞之間通信的介質(zhì)，可能也參與黑素小體的運輸。
越來越多的研究表明脂肪組織、炎癥反應(yīng)、非酒精性脂肪性肝（NAFLD）和酒精性脂肪性肝（AFLD）與肝細胞肝癌（HCC）的發(fā)生密切相關(guān)。最近，美國北卡羅萊那中央大學(xué)的研究者們提出脂肪細胞分泌的外泌體（AdExos）和HCC分泌的外泌體（HCCExos）營造了一個持續(xù)的慢性炎癥環(huán)境，導(dǎo)致HCC進展。AdExos和HCCExos均含有細胞特異性的細胞內(nèi)分子，包括各種mRNAs、microRNAs、lncRNAs、circRNAs、脂質(zhì)、代謝物以及蛋白。作為自分泌或旁分泌的信號分子，這些內(nèi)含物能激活與細胞增殖、血管生成、細胞浸潤、腫瘤惡化相關(guān)的信號通路，形成腫瘤微環(huán)境中脂肪細胞和HCC的動態(tài)互聯(lián)，造成HCC進展。
免疫檢查點抑制劑（ICI）的誕生是抗腫瘤藥物領(lǐng)域的重大創(chuàng)新，然而最近有報道表明ICI的抗腫瘤治療會引起不良心血管事件。不良心血管事件包括心肌炎與心肌病、心肌纖維化、心力衰竭和心包病變等。心臟的衰老過程伴隨著各種心臟疾病的發(fā)生。外泌體通過傳送各種生物分子（包括microRNA）來調(diào)控心臟疾病中細胞間的通訊聯(lián)系。miR-34a-5p是一個與心臟衰老相關(guān)的microRNA。溫州醫(yī)科大學(xué)的研究者們利用小鼠疾病模型研究了外泌體miR-34a-5p與PD-1抑制劑引起的心血管不適之間的關(guān)聯(lián)。他們發(fā)現(xiàn)，PD-1抑制劑處理過的巨噬細胞衍生的外泌體通過調(diào)控miR-34a-5p/PNUTS信號通路發(fā)揮促心肌衰老的作用。這一結(jié)果在線發(fā)表在J Immunother Cancer十月刊。
外泌體市場/臨床應(yīng)用
腫瘤患者血清中分離的外泌體，其內(nèi)含物miRNAs的表達譜與腫瘤進展緊密關(guān)聯(lián)。外泌體miRNAs被發(fā)現(xiàn)在反復(fù)凍融的環(huán)境里、在-208 °C的超低溫下存儲5年仍然保持穩(wěn)定。外泌體miRNAs的高穩(wěn)定性使其成為監(jiān)測疾病進展的有價值的生物標(biāo)志物。目前已在多個腫瘤類型中，包括非小細胞肺癌、鼻咽癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等，鑒定出可用于監(jiān)測腫瘤進展的外泌體來源的分子標(biāo)記。
2016年，依賴外泌體譜的腫瘤診斷產(chǎn)品在美國上市。ExoDx Prostate（IntelliScore）和ExoDx Lung（ALK）是基于液體活檢方法的兩種商品化檢測試劑盒，可分別用于檢測血清和尿液中前列腺癌或肺癌標(biāo)志物。對于肺癌和前列腺癌，常規(guī)的診斷方法是侵入性診斷法。而ExoDx Prostate（IntelliScore）使用非直腸指診尿樣，分析樣本中高分型前列腺癌患者攜帶的三種標(biāo)志物，然后使用專有算法分析結(jié)果并預(yù)測患病風(fēng)險。同樣，ExoDx Lung（ALK）利用定量PCR方法分析血清中的外泌體RNA，可檢測非小細胞肺癌中五種不同的EML4-ALK融合基因轉(zhuǎn)錄本，此方法可用于有患肺癌風(fēng)險人群的預(yù)后檢測。
由于外泌體具有與當(dāng)前用作藥物遞送系統(tǒng)的納米顆粒相似的特性，比如穩(wěn)定性、通透性、免疫原性較低、毒性較低、生物相容性高等，外泌體也可被用作臨床治療的給藥工具。臨床藥物研究中，除傳統(tǒng)的化療藥物外，天然產(chǎn)物和干擾小RNA已成功封裝在外泌體中，用于靶向治療乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌和成膠質(zhì)細胞瘤。
外泌體分離提取
外泌體的分離方法有很多種，常用的有超速離心法、密度梯度超速離心法、多聚物沉淀法（PEG）、免疫磁珠法、試劑盒分離法等。
商品化試劑盒多采用聚乙二醇沉淀法、超濾法和免疫學(xué)方法分離外泌體。
超速離心法和密度梯度離心法是最常用的外泌體純化手段。這兩種手段因獲得的囊泡數(shù)量較多而廣受歡迎，但過程比較費時，而且對儀器設(shè)備要求高（需要超速離心機）且回收率不穩(wěn)定，純度也達不到要求。
多聚物沉淀法操作簡便，不需要額外的設(shè)備，然而PEG沉淀會夾雜分離大量雜質(zhì)(蛋白、脂類等)，顆粒大小不均一，存在于分離物中的聚合物也可能會干擾下游分析。
免疫磁珠法利用包被單克隆抗體的磁珠結(jié)合外泌體，可保證外泌體形態(tài)的完整，特異性高，但免疫沉淀需要特異性抗體，檢測成本高，且僅能捕獲表達特定抗原的目標(biāo)外泌體，效率低，外泌體生物活性易受pH和鹽濃度影響，囊泡完整性是個調(diào)整，不利于下游實驗。
綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)的方法提取到的外泌體，缺陷在于：收率較低，耗時長、純度不高，外泌體囊泡不完整等。
鑒于上述問題，武漢華美生物工程有限公司研發(fā)的外泌體提取試劑盒提供了一種簡單可靠的方法可從細胞培養(yǎng)上清液，血清，血漿，乳液，尿液，唾液，酵母中提取完整的外泌體。該產(chǎn)品提取的外泌體囊泡適用于下游的電鏡分析、NTA分析、納米流式（NanoFCM）分析、Western Blot、熒光定量（qPCR）和高通量測序等應(yīng)用。
該試劑盒通過蛋白親和的方式分離外泌體，無需超速離心即可實現(xiàn)高效率地從各種類型樣本中提取高純度、囊泡結(jié)構(gòu)完整的外泌體，具有簡便、穩(wěn)定、易操作的優(yōu)點。
武漢華美生物工程有限公司(www.pptc.cn)成立于2007年12月，是一家集科研、生產(chǎn)、銷售為一體的生物高新技術(shù)企業(yè)。并形成了以CUSABIO為品牌的ELISA試劑盒、蛋白、抗體等多種優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品，遠銷歐美日德等九十多個國家。
2018年3月31日，華美生物兄弟公司生之源與2013年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎得主蘭迪·謝克曼教授舉行簽約儀式，并建立諾貝爾獎工作站。此舉大大助推了華美外泌體相關(guān)科研產(chǎn)品的研究和生產(chǎn)！
華美生物研發(fā)的外泌體(Exosome)提取試劑盒廣泛兼容各種樣本類型和各種細胞上清液(如A375，HEPG2，PC-3，Hela，U87，MG63等)，為廣大生物醫(yī)學(xué)科研學(xué)者提供高質(zhì)量的產(chǎn)品與技術(shù)服務(wù)。
外泌體研究吸引著生命科學(xué)各個領(lǐng)域的科學(xué)家。華美CUSABIO提供外泌體提取試劑盒，將助力研究人員探秘其功能，擴大其醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
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外泌體未來展望
外泌體爆炸性研究活動已經(jīng)慢慢演變?yōu)榉肿俞t(yī)學(xué)的快速發(fā)展。外泌體在臨床醫(yī)學(xué)中有十分光明的應(yīng)用前景，主要是因為它們含有豐富的生物標(biāo)志物，可用于監(jiān)測臨床狀態(tài)、診斷疾病、治療反應(yīng)、疾病進展等。重要且有影響力外泌體研究領(lǐng)域會隨著高效率的外泌體分離技術(shù)的發(fā)展而發(fā)展。
外泌體可作為生物標(biāo)志物用于疾病的診斷，也推動了以外泌體為靶標(biāo)的治療方法研究或?qū)⑼饷隗w本身用作治療工具的研究。將外泌體用作治療工具的臨床研究正在開展之中，其目的是研究患者自身MSC分泌外泌體或健康捐贈者體內(nèi)外泌體用于治療的安全性和有效性。這個趨勢下，外泌體用作藥物輸送系統(tǒng)作為基因治療的潛在載體有可能變得更加普遍。外泌體在癌癥中同時發(fā)揮免疫激活和免疫抑制功能，外泌體腫瘤免疫療法有望誕生抗癌疫苗。更全面的了解外泌體功能，促進“有益”外泌體的分泌，抑制“有害”外泌體的分泌，從而實現(xiàn)疾病的預(yù)防與治療。隨著完整外泌體和它們的功能的逐漸解密，預(yù)計在不久的將來，更多令人興奮的外泌體應(yīng)用將會出現(xiàn)。
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