基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)可以揭示蛋白質(zhì)的功能，不過要精確控制基因的表達(dá)還比較困難，特別是在合成生物學(xué)和基因治療領(lǐng)域?，F(xiàn)在科學(xué)家們利用CRISPR技術(shù)構(gòu)建出了一種新型載體，該載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白合成脈沖之后就會(huì)降解，由此控制蛋白質(zhì)的表達(dá)量和表達(dá)時(shí)間。這項(xiàng)研究發(fā)表在Nucleic Acids Research雜志上。

為了實(shí)現(xiàn)精確可控的基因遞送，德克薩斯大學(xué)Leonidas Bleris決定帶領(lǐng)研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)半衰期短的質(zhì)粒，“我們很快決定采用CRISPR-Cas9技術(shù)，”他說。

研究人員設(shè)計(jì)的質(zhì)粒載體攜帶有目的基因、Cas9核酸酶和引導(dǎo)Cas9剪切的gRNA。當(dāng)這樣的質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞之后，就會(huì)生產(chǎn)這三種蛋白。隨后gRNA引導(dǎo)Cas9酶去切掉質(zhì)粒，抑制進(jìn)一步的蛋白生產(chǎn)并降解載體。而已經(jīng)表達(dá)的蛋白最終會(huì)被細(xì)胞分解掉。

研究人員在這個(gè)質(zhì)粒中添加了方便檢測(cè)的熒光蛋白mKate2，還選擇了兩種在人類基因組中脫靶最少的gRNA。由于mKate2半衰期較長(zhǎng)，研究人員在它的C端加上了加速其降解的氨基酸序列。研究顯示，質(zhì)粒進(jìn)入人類細(xì)胞后產(chǎn)生了明亮的熒光脈沖，熒光在七小時(shí)之后達(dá)到峰值，隨后慢慢衰退。

在證明了質(zhì)粒的有效性之后，研究人員開始對(duì)這一系統(tǒng)進(jìn)行微調(diào)。他們通過計(jì)算機(jī)模擬分析了載體量、mKate2穩(wěn)定性、剪切復(fù)合體與靶點(diǎn)親和力所產(chǎn)生的影響，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了不同版本的遞送系統(tǒng)。“蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和CRISPR系統(tǒng)的剪切效率，決定著蛋白的表達(dá)量和表達(dá)時(shí)間，”Bleris說。

研究人員建立了能夠滿足一系列遞送性能的載體文庫(kù)，包括不同的蛋白合成量和蛋白合成時(shí)間。除了提供基因治療所必須的精確控制，這些載體在合成生物學(xué)中也很有價(jià)值。“這一機(jī)制還可以用來實(shí)現(xiàn)無痕遞送，甚至保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)，”他補(bǔ)充道。舉例來說，讓gRNA靶標(biāo)遞送載體上的多個(gè)靶標(biāo)，可以在引入治療性蛋白之后將載體完全降解，以保護(hù)載體上的專利序列。