具有敲除或突變等位基因的人類多能干細(xì)胞（hPSCs），可以通過定制設(shè)計的核酸酶產(chǎn)生。轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs）和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)-Cas9核酸酶，是編輯hPSC基因組最常用的技術(shù)。

1月6日，Cell子刊《Cell Stem Cell》在線發(fā)表了來自哈佛大學(xué)和麻省總醫(yī)院研究人員的一篇綜述文章，題為“Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions”。在這篇綜述文章中，研究人員簡單回顧了定制設(shè)計的核酸酶在hPSCs基因編輯中的應(yīng)用，集中關(guān)注TALENs和CRISPR/Cas9的實際應(yīng)用。突出了每種方法的優(yōu)缺點，并討論了實驗設(shè)計的理論和技術(shù)方面的考慮。

人類胚胎干細(xì)胞（hESCs）的分離和人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）重編程的發(fā)現(xiàn)，使干細(xì)胞生物學(xué)、體外疾病模型和藥物發(fā)現(xiàn)重新復(fù)興起來。在一般情況下，基于hPSC的疾病模型非常適合于研究遺傳變異。例如，研究通常將病人來源的hiPSCs——攜帶有導(dǎo)致疾病的基因突變，與（年齡相仿的）對照組衍生hiPSCs進行比較——通常分化為受影響的細(xì)胞類型，如神經(jīng)細(xì)胞或肝細(xì)胞。這種疾病建模策略需要注意，分化的傾向和表型特性的可變性，即使在來自同一供體的hPSCs中。

不過，即使一個給定突變的細(xì)胞表型是強大的、高度滲透的，也可能由于無關(guān)hPSC細(xì)胞系遺傳背景中差異的混淆影響，而發(fā)生缺失。為了克服這一障礙，一種非常強大的方法是，使用定制設(shè)計的核酸內(nèi)切酶，使研究人員能夠?qū)?nèi)源性hPSC基因組序列進行精確和可編程的修飾。這種基因組工程戰(zhàn)略，對于研究人類生物學(xué)和疾病將是非常有價值的。

傳遞到細(xì)胞內(nèi)之后，定制設(shè)計的核酸酶將特定的雙鏈斷裂（DSBs）引入DNA，可通過易出錯的非同源末端連接（NHEJ）或精確的同源指導(dǎo)修復(fù)（HDR），而得以修復(fù)。通過NHEJ的DSB修復(fù)，通常會導(dǎo)致靶位點中小的插入/缺失（indel）。這些缺失可造成移碼突變，從而導(dǎo)致蛋白編碼基因的功能性敲除。雙鏈DSBs將通過NHEJ修復(fù)，從而刪除完全插入的序列。精確的遺傳修飾（如核苷酸替換或刪除）是由外源DNA供體模板的共同傳遞完成的。

大多數(shù)的工程核酸酶包括一個可定制的、序列特異性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與一段非特異性的DNA核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域熔合。雖然自然發(fā)生的歸巢核酸內(nèi)切酶或大范圍核酸酶已被成功用于基因組工程，但是它們在hPSCs基因組編輯中的應(yīng)用，一直都是非常有限的。成功用于hPSCs基因組編輯的第一個定制設(shè)計、位點特異性內(nèi)切酶，是鋅指核酸酶（ZFNs）。ZFNs的設(shè)計相對比較困難，它們的設(shè)計以及在實驗室中的構(gòu)建，在技術(shù)上仍然具有挑戰(zhàn)性。

另一個定制設(shè)計的核酸內(nèi)切酶是TALEN。像ZENs一樣，TALENs包括一段定制的TALE DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與非特異性的Fokl核酸酶結(jié)構(gòu)域熔合。TALEN介導(dǎo)的hPSCs基因組編輯，已被用于產(chǎn)生hPSC基因報告細(xì)胞系、基因的雙等位基因敲除以及點突變的修復(fù)和引入。

Cas9系統(tǒng)包含Cas9核酸酶和短的非編碼CRISPR RNA序列，稱為sgRNA。這些sgRNAs包含一段定制的20核苷酸序列，將共表達的Cas9核酸酶引導(dǎo)到sgRNA靶序列上，用以產(chǎn)生位點特異性的DSB。

在這項綜述中，作者討論了TALEN-和CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯程序用于hPSCs基因組編輯中，并可遵循一個通用的工作流程，并強調(diào)了所存在的問題、未預(yù)料到的困難和與之對應(yīng)的解決方案。這篇綜述文章中所描述的許多基因編輯方法，已經(jīng)在其他類型的細(xì)胞中得以驗證，但是只要有可能，就可以將它們應(yīng)用于hPSCs。