上世紀(jì)八十年代Cetus Corporation公司的化學(xué)家Kary Mullis發(fā)明了PCR，如今DNA擴(kuò)增儼然已經(jīng)成為了生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。三十多年以來，人們?yōu)榱私鉀Q研究中出現(xiàn)的新問題新需求，不斷對(duì)這一經(jīng)典技術(shù)進(jìn)行改良。從經(jīng)典PCR、實(shí)時(shí)定量PCR再到現(xiàn)在的數(shù)字PCR，PCR技術(shù)在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。如今PCR技術(shù)早已走出實(shí)驗(yàn)室，在遺傳學(xué)鑒定和疾病診斷中發(fā)揮著巨大的作用，在越來越廣闊的領(lǐng)域里煥發(fā)著新的活力。

PCR方法大比拼

PCR的原理在這里無庸贅述。多年來，研究者們已經(jīng)在此基礎(chǔ)上開發(fā)了一系列衍生技術(shù)。目前的PCR方法主要可以分為三類：終點(diǎn)PCR、qPCR和dPCR。

終點(diǎn)PCR

終點(diǎn)PCR是最原始、最簡(jiǎn)單的PCR方法，如今仍在被我們廣泛使用。使用者只能在PCR反應(yīng)結(jié)束之后，通過凝膠電泳、毛細(xì)管電泳等方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。終點(diǎn)PCR本身是無法定量的，因?yàn)樵摲磻?yīng)產(chǎn)出的DNA量不一定能反映最初情況。舉例來說，不同樣品和序列的擴(kuò)增效率是有差異的。

qPCR和dPCR

研究者們通過兩種途徑克服了PCR定量分析的挑戰(zhàn)：實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）和數(shù)字PCR（dPCR）。qPCR主要是利用插入性染料或熒光探針（比如TaqMan），人們可以通過監(jiān)控PCR過程中的熒光強(qiáng)度比較多個(gè)樣品的DNA水平。數(shù)字PCR（dPCR）的基本工作原理很簡(jiǎn)單，先將樣品劃分為多個(gè)PCR反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)最多只含有一個(gè)模板。然后通過計(jì)數(shù)正負(fù)反應(yīng)來確定初始樣品中模板分子的數(shù)量。生物通 www.ebiotrade.com

SYBR® Green是一種在qPCR中廣泛使用的插入性DNA染料。隨著PCR循環(huán)的連續(xù)進(jìn)行，這種染料的熒光強(qiáng)度會(huì)不斷增強(qiáng)，從而可以使人們對(duì)反應(yīng)中的DNA進(jìn)行定量。SYBR Green法比探針法成本低，使用也更為方便。不過這種方法也存在著與生俱來的弊端，SYBR Green方法產(chǎn)生的非特異性產(chǎn)物較多，會(huì)導(dǎo)致高背景和假陽(yáng)性。盡管如此，這一久經(jīng)考驗(yàn)的技術(shù)仍然頗為流行，許多研究人員都是SYBR Green法的忠實(shí)擁護(hù)者，愿意接受這個(gè)技術(shù)的小瑕疵。

雖然qPCR和dPCR都能夠?qū)悠分械暮怂徇M(jìn)行定量，但它們有一個(gè)重要的差別。qPCR只能實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量（比如樣品A的靶序列是樣品B的兩倍），除非用標(biāo)準(zhǔn)品生成一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。而數(shù)字PCR本身就是絕對(duì)定量的，不需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線。另一方面，qPCR技術(shù)更為成熟名頭也更響，市面上有大量的商業(yè)化產(chǎn)品可供選擇。dPCR目前還是個(gè)小鮮肉，應(yīng)用沒有qPCR那么廣泛，價(jià)格也更昂貴一些。與dPCR相比，qPCR更適合高通量分析，而且動(dòng)態(tài)范圍很寬。

dPCR一般來說更為精確。qPCR能夠輕易分辨兩倍的濃度差異（比如5拷貝和10拷貝），但在微小差異面前比較無力。而dPCR在理論上能鑒別差異小于20%的拷貝數(shù)，比如5拷貝和6拷貝。這種精確性在有些方面特別有幫助，比如定量涉及染色體重排的基因拷貝數(shù)，或者定量癌癥患者血液中的循環(huán)生物學(xué)指標(biāo)。由于dPCR分液相當(dāng)于稀釋樣品，而且在反應(yīng)結(jié)束時(shí)讀取數(shù)據(jù)，dPCR比qPCR更能抵抗抑制劑。

重組酶聚合酶擴(kuò)增RPA（Recombinase Polymerase Amplification）被稱為是可以替代PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)。RPA主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）和鏈置換DNA聚合酶。該反應(yīng)的最適溫度在37°C - 42°C之間，無需變性在常溫下即可進(jìn)行，這無疑能大大加快擴(kuò)增速度。RPA檢測(cè)的靈敏度也很高，能夠?qū)⒑哿康暮怂幔ㄓ绕涫?span lang="EN-US">DNA）模板擴(kuò)增到可以檢出的水平，從單個(gè)模板分子得到大約1012擴(kuò)增產(chǎn)物。RPA用不著復(fù)雜的樣品處理也不需要溫控設(shè)備，適合無法提取核酸的實(shí)地應(yīng)用，真正實(shí)現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測(cè)。英國(guó)公司TwistDx Inc以RPA為基礎(chǔ)開發(fā)了TwistAmp® 核酸擴(kuò)增產(chǎn)品，能夠在15分鐘內(nèi)進(jìn)行常溫下的單分子核酸檢測(cè)。