同源重組介導(dǎo)的基因工程，已廣泛應(yīng)用于原核生物中，并具有較高的效率和準(zhǔn)確性。然而，用這種方法來實(shí)現(xiàn)更大規(guī)模的基因組編輯（具有許多基因或大的DNA片段），還是有限的，因?yàn)?/span>DNA編輯模板構(gòu)建的程序相對復(fù)雜。11月24日，在《Scientific Reports》發(fā)表的一項(xiàng)研究中，山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的祁慶生教授帶領(lǐng)的研究小組，描述了一個(gè)CRISPR-Cas9輔助的非同源末端連接（CA-NHEJ）策略，用于細(xì)菌基因高效而快速的失活——以一種不依賴同源重組的方式，并無需無選擇標(biāo)記的使用。

容易和有效地精確操縱真核生物和原核生物的基因組，在各種應(yīng)用中——從功能基因組位點(diǎn)的遺傳分析到人為代謝流量再分配，是非常理想的。為此，同源重組（HR）為基礎(chǔ)的基因組工程已被廣泛應(yīng)用。基于噬菌體的重組蛋白的引入，徹底改變了這個(gè)過程，從而實(shí)現(xiàn)了高效的遺傳操作，特別是在原核生物中。λ-Red和Rec E／T是兩個(gè)著名的重組系統(tǒng)，已被廣泛使用；然而，高效的HR都需要一個(gè)供體DNA片段（兩側(cè)是同源性序列）作為編輯模板。此外，篩選具有理想表型的遺傳變異，需要選擇性標(biāo)記的染色體整合（通常是一個(gè)抗生素抗性標(biāo)記），其次是它的最終去除以用于迭代工程。

CRISPRs和CRISPR相關(guān)蛋白（Cas）蛋白的新應(yīng)用，已經(jīng)徹底改變了基因組工程。在單引導(dǎo)性RNA（sgRNA）的指導(dǎo)下，CRISPR-Cas9系統(tǒng)可在任何基因組位點(diǎn)上產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSBs）。這些DSBs可以由HR或通過非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)。在高等生物中，相比較HR而言，NHEJ是主要的DNA修復(fù)系統(tǒng)，來維持基因組的穩(wěn)定性。NHEJ完全適合于管理DSBs，因?yàn)檫@條路徑?jīng)]有顯示出對DNA末端結(jié)扎的序列要求。

然而，由于斷裂的DNA末端經(jīng)常損壞，并需要進(jìn)行修改，NHEJ修復(fù)機(jī)制往往容易在結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生插入或缺失（indel）突變。因此，在可編程的CRISPR-Cas9 DNA切割系統(tǒng)的幫助下，NHEJ能產(chǎn)生移碼突變，破壞靶基因，而無需使用同源修復(fù)供體。而在原核生物中，這一強(qiáng)大的DNA修復(fù)機(jī)制并不普遍，由于它們普遍缺乏NHEJ途徑，Cas9產(chǎn)生的DSB對大多數(shù)微生物是致命的。最近的研究表明，參與真核生物NHEJ的關(guān)鍵因素——Ku70/Ku80二聚體和DNA連接酶IV，在原核生物中存在功能性的同系物。細(xì)菌的Ku蛋白在尺寸上比它們的真核生物相對物小得多，但卻通過在斷端形成環(huán)形的同型二聚體結(jié)構(gòu)，而保護(hù)受損的DNA。

在某些物種中，如結(jié)核分枝桿菌和芽孢桿菌，保守的原核NHEJ途徑可保護(hù)細(xì)菌基因組免于意想不到的DSBs，并促進(jìn)遺傳變異。該系統(tǒng)也可以被利用來開發(fā)一種細(xì)菌基因組工程方法，比依賴于HR的基因組工程方法更簡單，其中選擇性標(biāo)記和供體DNA模板是不必要的。

在這項(xiàng)研究中，研究人員描述了一個(gè)CRISPR-Cas9輔助的非同源末端連接（CA-NHEJ）策略，用于細(xì)菌基因高效而快速的失活——以一種不依賴同源重組的方式，并無需無選擇標(biāo)記的使用。該研究表明，CA-NHEJ可以用來一步式地刪除大的染色體DNA片段，而無需同源DNA模板。因此，它是一種新的和功能強(qiáng)大的工具，用于細(xì)菌基因組編輯，并具有加速基因組進(jìn)化的潛力。