美國國立衛(wèi)生研究院眼科研究所的一組研究人員報道了最新成果：他們通過一種病毒載體直接向眼睛輸送了基于CRISPR-as9的治療元件，成功在視網(wǎng)膜變性小鼠中阻止了視網(wǎng)膜色素變性。這一研究成果公布在3月14日的Nature Communications雜志上，文章的通訊作者是美國國立衛(wèi)生研究院眼科研究所的吳志堅研究員（Zhijian Wu，音譯）。

視網(wǎng)膜色素變性（Retinitis pigmentosa）是一種具有明顯遺傳傾向的慢性、進行性視網(wǎng)膜色素上皮和光感受器的變性疾病，發(fā)病率大約為四千分之一，會引發(fā)視網(wǎng)膜變性，并最終導致失明。這種遺傳性疾病已與超過60個基因（和超過3,000個突變）相關聯(lián)，因此為基因治療增加了難度，最新這項研究的結(jié)果表明，基于基因編輯的更廣泛治療方法可用于靶向視網(wǎng)膜色素變性中的多個遺傳缺陷。

在視網(wǎng)膜的眼后部組織中有兩種類型的細胞，能將光轉(zhuǎn)換成電信號發(fā)給大腦，視桿光感受器能在昏暗的光線下產(chǎn)生視覺，而視錐光感受器則能在光照條件下實現(xiàn)色彩視覺和觀察。遺傳突變主要影響前者，導致夜盲癥，就像是視網(wǎng)膜色素變性患者看到的那樣。不過由于視桿光感受器也會為視錐光感受器提供重要的結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)支持，因此視桿光感受器障礙或死亡會導致視錐光感受器變性和失明。

為此眼科研究所眼部基因治療中心主任吳志堅等人設計了一種CRISPR單導向RNA（sgRNA），靶向視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)錄因子：神經(jīng)視網(wǎng)膜亮氨酸拉鏈（Neural retina leucine zipper，Nrl），Nrl能調(diào)控視網(wǎng)膜發(fā)育過程中特殊視桿細胞的命運，并維持成熟視網(wǎng)膜內(nèi)的視桿細胞。研究小組將Nrl-sgRNA和Cas9內(nèi)切核酸酶通過兩個單獨的腺相關病毒（AAV）載體，直接遞送到小鼠視網(wǎng)膜上。他們指出，這種AAV載體的優(yōu)點就是能維持非分裂細胞（例如視網(wǎng)膜細胞）中長期基因表達的能力。

來自華盛頓大學醫(yī)學院的神經(jīng)病理學家Joseph Corbo（未參與該項研究）表示，“目前缺乏針對視網(wǎng)膜變性的有效治療，特別是缺乏這種疾病不同遺傳變異的治療，這項研究是我們領域中非常令人激動的一項重要進步”。Corbo實驗室是第一個發(fā)現(xiàn)靶向Nrl可以保留小鼠視錐細胞功能的實驗室。

在最新研究中，研究人員利用基于Cre的重組系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)敲除Nrl可以將視桿細胞部分轉(zhuǎn)換類似視錐細胞，防止視桿細胞的死亡以及視網(wǎng)膜色素變性中二級視錐細胞的死亡。

吳志堅研究員表示，“我們的想法不是將視桿細胞轉(zhuǎn)變成真正的視錐細胞，而是令它們獲得一些視錐細胞的特征，從而能低空引發(fā)其最終死亡的突變影響。”

但Cre重組方法并不使用于人體，因此研究人員轉(zhuǎn)向了CRISPR系統(tǒng)。 “這項新工作獲得了兩個方面的進步：作者采用了了一種AAV介導的CRISPR-Cas9遞送系統(tǒng)，可以應用于人類患者，并且他們指出了這種策略可以在多種視網(wǎng)膜變性模型中起作用。”

研究組首先將實驗治療載體注射到2周齡野生型小鼠的視網(wǎng)膜中，然后觀察小鼠在三至四個月內(nèi)的變化。與注射對照載體的小鼠相比，接受治療的小鼠Nr1表達量降低。在注射后第6周，治療小鼠視桿細胞出現(xiàn)了下調(diào)的視桿細胞基因，以及上調(diào)的視錐細胞基因。同時研究人員也指出，這種治療不會對視錐細胞產(chǎn)生任何有害作用。

這種完整消除Nrl的效果令人印象深刻，也是這項工作的一個關鍵成果。

然后，研究組在三種不同的視網(wǎng)膜色素變性小鼠模型上檢測了載體，其中包括視紫紅質(zhì)基因中表達顯性人類突變的模型，之后再觀察幾個月后小鼠的變化，結(jié)果表明在所有三種情況下，治療小鼠保留了更多的視桿細胞，阻止了視桿細胞和視錐細胞的死亡。

去年年初，美國Cedars-Sinai醫(yī)學中心的研究人員利用CRISPR-Cas9刪除視網(wǎng)膜色素變性的遺傳突變，他們將這個系統(tǒng)注入年輕的實驗室大鼠體內(nèi)，這種大鼠已被改造成模擬一種遺傳性視網(wǎng)膜色素變性，稱為常染色體顯性遺傳，這涉及到該基因的突變。單次注射后，通過視動反射測量——包括轉(zhuǎn)動頭部響應運動不同亮度的條紋，研究人員發(fā)現(xiàn)，與對照組動物相比，這些大鼠的視力變得更好。華人女學者用CRISPR技術改善遺傳性失明之后，哥倫比亞大學醫(yī)學中心（CUMC）等處的Stephen Tsang等人也利用一種基于CRISPR的方法來修復人類和小鼠視網(wǎng)膜色素變性相關的突變，而他們利用的是視網(wǎng)膜色素變性患者的皮膚樣品制備干細胞。由于病人來源的干細胞仍攜帶有致病基因突變，因此，該研究團隊使用CRISPR來修復有缺陷的基因。干細胞可被轉(zhuǎn)化為健康的視網(wǎng)膜細胞，并移植到同一患者中來治療視力喪失。研究人員靶定了視網(wǎng)膜色素變性最常見的一個變體，它是由RGPR基因中一個單一錯誤引起的。RGPR的組成——其中包含許多重復和緊密結(jié)合的核苷酸對，使它成為一個很難編輯的基因。

對于最新成果，Tsang表示，“這種類型的‘不精確醫(yī)學方法’可能患有視網(wǎng)膜色素變性的任何患者的第一個應用，因為有67個基因。”

不過在人體進行檢測之前，還需要回答幾個問題，比如Cas9的長期表達是否對視網(wǎng)膜有害，以及Nrl的消除在人體中是否能有小鼠中相同的效果。

佛羅里達大學的Shannon Boye評論道，“還需要更多的研究來確保實驗結(jié)果，但這些研究對于分析CRISPR-Cas9在有絲分裂后神經(jīng)元中的作用方面令人鼓舞。”

“CRISPR技術與腺相關病毒載體的組合，這嘗試真正將遺傳信息遞送到視網(wǎng)膜上，也許代表了視桿細胞相關退行性疾病治療方面的第一步。”