盡管人們已經(jīng)對許多生物進(jìn)行了基因組測序，但對樹蛙和藍(lán)莓這些非模式生物的基因組還并不了解。正因如此，在非模式生物中進(jìn)行基因表達(dá)分析，很容易得到新的發(fā)現(xiàn)。

 

目前，小鼠、擬南芥等模式生物的基因組和轉(zhuǎn)錄組已經(jīng)被充分測序，各路商家在此基礎(chǔ)上開發(fā)了大量商業(yè)化芯片、qPCR引物、探針組合和一些其他試劑。這些現(xiàn)成的工具為基因表達(dá)分析帶來了很大的幫助。

 

然而在另一方面，人們研究非模式生物的基因表達(dá)時，可以選擇的工具卻比較少。不過，這種障礙并不是無法克服的。在二代測序（NGS）、云計(jì)算以及一些軟件的幫助下，所有人都可以成為非主流基因表達(dá)研究的專家。

 

RNA測序

 

在過去，樹蛙研究者需要通過長時間的實(shí)驗(yàn)來構(gòu)建EST（表達(dá)序列標(biāo)簽）或cDNA芯片，再利用這些工具捕獲mRNA，最后進(jìn)行基因表達(dá)的分析。如今，RNA-seq可以完美的取代上述技術(shù)，美國國家基因組資源中心（NCGR）的研究副主席Callum Bell說。

 

為RNA-seq實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備其實(shí)與制備cDNA文庫差不多，只不過在最后“有人幫你進(jìn)行測序，就是這么簡單，”北卡羅來納大學(xué)的生物信息學(xué)和基因組學(xué)副教授Ann Loraine說，他正在研究藍(lán)莓中的生物活性物質(zhì)。

 

不過RNA-seq的成本相對較高，因此Loraine提醒研究者們，要在測序開始前先確定好自己的研究重點(diǎn)，例如研究植物/動物的哪些部分，或者哪些發(fā)育階段。

 

在對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序之后，我們需要將讀取結(jié)果裝配成為轉(zhuǎn)錄本，并對其加以注釋。對于非模式生物來說，這樣的注釋工作可能比較困難。“我們需要通過可靠途徑來解析轉(zhuǎn)錄本的功能，”Bell說。NCGR使用的是蛋白模體的隱馬爾可夫模型數(shù)據(jù)庫（例如TIGRFAM）。人們可以利用這些資源找到開放閱讀框，并將序列翻譯成為氨基酸。獲得了氨基酸序列之后，就可以通過BLASTP等工具在蛋白數(shù)據(jù)庫（如SWISS-PROT）中尋找同源蛋白。

 

在過去的日子里，人們需要利用轉(zhuǎn)錄本構(gòu)建芯片，以便檢測基因表達(dá)的水平和模式。但現(xiàn)在，“倒不如就通過RNA-seq”來獲得上述信息，英屬哥倫比亞大學(xué)的計(jì)算生物學(xué)家Paul Pavlidis說。

 

為了幫助研究者們理解自己得到的轉(zhuǎn)錄本，Loraine的實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了大量的計(jì)算工具。舉例來說，他們開發(fā)的CressExpress軟件利用了Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫等公共數(shù)據(jù)源，在輸入給定基因之后，可以查詢同一個基因組中具有類似表達(dá)模式的其他基因。此外，Pathway Tools可以幫助人們預(yù)測涉及了給定基因的代謝通路。Loraine實(shí)驗(yàn)室還開發(fā)了一個被稱為綜合基因組瀏覽器（Integrated Genome Brower）的可視化軟件，該軟件可以幫助人們直觀比對測序讀取的結(jié)果。

 

尋求合作

 

不是所有的實(shí)驗(yàn)室都擁有擅長NGS或生物信息學(xué)的人才。“測序儀器也還沒有那么普及，” Bell說，盡管臺式測序儀（例如Illumina公司的MiSeq和Life Technology公司的Ion Torrent）正在慢慢改變這一現(xiàn)狀。

 

另一方面，像NCGR這樣的大型核心機(jī)構(gòu)，“已經(jīng)積累了進(jìn)行這些復(fù)雜實(shí)驗(yàn)的豐富經(jīng)驗(yàn)，”Bell說?，F(xiàn)在越來越多的測序數(shù)據(jù)分析，開始采用云計(jì)算基礎(chǔ)設(shè)施，NCGR自己就在“開發(fā)私有的云計(jì)算設(shè)施，以便為科學(xué)家們提供相應(yīng)的服務(wù)，”他說。

 

目前，許多盈利性機(jī)構(gòu)和非盈利性的核心機(jī)構(gòu)，都能為用戶提供付費(fèi)的生物信息學(xué)服務(wù)。有些可能擁有專門的生物信息學(xué)團(tuán)隊(duì)，另一些則主要依賴于云計(jì)算進(jìn)行分析。

 

這些第三方機(jī)構(gòu)可以提交分析報告，幫助我們理解測序數(shù)據(jù)的含義。不過，別指望他們能將研究結(jié)論雙手奉上，因?yàn)樯飳W(xué)或臨床問題的最終解讀，還得取決于研究者自身的專業(yè)知識。

 

進(jìn)行驗(yàn)證

 

測序可以幫助我們分析基因在不同情況下的差異性表達(dá)，例如成熟果實(shí)和未成熟果實(shí)，皮膚組織和腸道組織等。不過這只是一種初步分析，我們還需要通過qPCR等技術(shù)對數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。

 

Pavlidis指出，初步分析之后的小規(guī)模實(shí)驗(yàn)（少于200個基因），就不用繼續(xù)進(jìn)行RNA-seq了，因?yàn)槌杀据^低的qPCR在這種情況下更加劃算。

 

Life Technologies公司的資深產(chǎn)品經(jīng)理Sundiep Phanse，推薦大家在做qPCR之前，先在該公司的產(chǎn)品目錄里找找有沒有符合要求的產(chǎn)品。據(jù)介紹，Life Technologies公司提供了超過一百三十萬預(yù)設(shè)計(jì)的TaqMan assays，“此外你還可以根據(jù)自己的需要進(jìn)行定制”。

 

Bio-Rad公司的市場經(jīng)理Sam Ropp提醒大家，不論是購買預(yù)設(shè)計(jì)的產(chǎn)品，還是自行通過Primer3設(shè)計(jì)引物都應(yīng)該考慮到自己序列的特點(diǎn)。舉例來說，像單核苷酸多態(tài)性、二級結(jié)構(gòu)和可變剪切這樣的變量，會對引物的定位產(chǎn)生影響。

 

對非模式生物展開研究無疑會遇到各種挑戰(zhàn)，不過只要樹立正確的信念，找到合適的工具和資源，我們就可以收獲只屬于勇敢者的獎勵。