免疫組化（IHC/ICC）方案
原理
免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特 異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離 子、同位素)顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)),對(duì)其進(jìn)行定位、定 性及相對(duì)定量的研究，稱(chēng)為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。
抗體和抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性，免疫組織化學(xué)正是利用了 這一原理。先將組織或細(xì)胞中的某種化學(xué)物質(zhì)提取出來(lái)，以此作為抗原或半 抗原，通過(guò)免疫動(dòng)物后獲得特異性的抗體，再以此抗體去探測(cè)組織或細(xì)胞中 的同類(lèi)的抗原物質(zhì)。由于抗原與抗體的復(fù)合物是無(wú)色的，因此還必須借助于 組織化學(xué)的方法將抗原抗體結(jié)合的部位顯示出來(lái)，以期達(dá)到對(duì)組織或細(xì)胞 中的未知抗原進(jìn)行定性，定位或定量的研究。
用途
對(duì)組織或細(xì)胞中的未知抗原進(jìn)行定性，定位或定量。
步驟（以石蠟切片為例）
1. 脫蠟和水合
去除切片中的石蠟，暴露組織。進(jìn)一步，恢復(fù)組織的水環(huán)境，以幫助檢測(cè)。
(1) 用二甲苯或環(huán)保脫蠟劑浸泡切片至少60分鐘，使組織脫蠟。在這道工序 之前，最好先加熱切片融化石蠟，這樣對(duì)去除石蠟會(huì)更有效。
(2) 將染色架依次置于100%、100%、95%、85%、75%、60%梯度酒精中，分別浸泡5min。
(3) 0.3% TritonX-100用于滲透細(xì)胞膜，有助于分子進(jìn)入靶細(xì)胞，5分鐘即可。
注意事項(xiàng)：
a. 全程保持切片各部位呈濕潤(rùn)狀態(tài)，否則會(huì)有很高的背景。
b. 二甲苯有毒，可以用組織透明脫蠟劑代替。
c. 脫蠟前可對(duì)切片進(jìn)行加熱，以達(dá)到更好的脫蠟效果。
d. 通常使用2% APES- 丙酮緩沖液，通過(guò)將切片浸泡1min 并在60℃下加熱 15 min來(lái)防止切片上的組織剝離。
e. 脫蠟的時(shí)間因溫度和試劑的不同而有所不同。夏天，室溫比較高，可以適 當(dāng)縮短時(shí)間。此外，如果脫蠟劑已經(jīng)使用了一段時(shí)間，最好延長(zhǎng)使用時(shí)間 或更換新的試劑。
2. 清除內(nèi)源性酶干擾和抗原修復(fù)
在固定過(guò)程中，甲醛可以與組織中的抗原交聯(lián)，阻斷抗原決定因子。因此，有必要打開(kāi)抗原與甲醛的交聯(lián)效應(yīng)，以提高組織抗原的檢出率。有幾種方 法可以達(dá)到這一點(diǎn)，包括酶修復(fù)和熱修復(fù)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，熱修復(fù)效果優(yōu)于酶修復(fù)。此外，修復(fù)緩沖液也會(huì)影響抗原的恢復(fù)效果。有三種緩沖液的pH 值不同，包括檸檬酸緩沖液(pH 6.0),EDTA緩沖液(pH 8.0)和TE緩沖液(pH 9.0)。 一般pH值越高，修復(fù)力越強(qiáng)。內(nèi)源性酶，包括過(guò)氧化物酶和生物素，可與顯色底物DAB 和生物素標(biāo)記的二抗相互作用，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。所以我們需要去除內(nèi)源性酶。長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)證明，用ddH2O或 PBS 或TBS 或甲醇稀釋3%H2O2，在10分鐘之內(nèi)可以很好地消除內(nèi)源酶的影響。
(1) 用3%H2O2去除內(nèi)源酶干擾5min。
(2) 于pH 值7.4的PBS 中浸泡切片。
(3) 在1L燒杯中準(zhǔn)備500ml 檸檬酸鈉緩沖液，并放入高壓鍋中。將帶墊圈的 緩沖液在水浴中加熱至100℃。然后，將染色架放置在煮熟的緩沖液中。燒杯口用保鮮膜密封，防止水蒸氣在加熱過(guò)程中進(jìn)入緩沖液。用 1000w 的電源繼續(xù)加熱至高壓狀態(tài)，保持2分鐘，然后立即停止加熱。
(4) 等到高壓鍋?zhàn)匀焕鋮s，開(kāi)蓋取出燒杯，自然冷卻至室溫。
(5) PBS 分3次沖洗5分鐘。
3. 封閉
該過(guò)程是阻斷抗體與來(lái)自同一來(lái)源的二抗的血清的非特異性結(jié)合。用10%非免疫山羊血清阻塞組織，每片100μL,置于濕箱中室溫靜置30min。
4. 抗體解育
免疫組化實(shí)驗(yàn)應(yīng)選擇經(jīng)驗(yàn)證的一抗?？贵w的稀釋比和孵育時(shí)間應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行優(yōu)化。建議低溫和較長(zhǎng)的孵育時(shí)間，以確保抗體與抗原更好的結(jié)合。
(1) 除去封閉緩沖液。
(2) 將抗體稀釋至適當(dāng)濃度，加入組織中4℃解育過(guò)夜。我們推薦0.01μg/ml 作 為工作濃度。
(3) 用PBST 清洗切片3次，每次5 min。
(4) 按說(shuō)明書(shū)稀釋二抗至工作濃度，37℃孵育1小時(shí)。我們選擇生物素標(biāo)記 抗體作為二抗。
(5) 用PBST 清洗切片3次，每次5 min。
(6) 第三個(gè)抗體按說(shuō)明書(shū)稀釋至工作濃度，37℃孵育1h。
(7) 用PBST 清洗切片3次，每次5 min。
注意事項(xiàng)：
a. 為尋求最佳抗體孵育濃度，在正式實(shí)驗(yàn)前應(yīng)通過(guò)設(shè)置梯度稀釋進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)。
b. 建議抗體在低溫條件下孵育較長(zhǎng)的時(shí)間，以確?？贵w和抗原的充分結(jié)合。 c.切片必須輕柔地清洗干凈，特別是在孵育不同抗體時(shí)。
5. 染色
這個(gè)過(guò)程中用到不同的檢測(cè)系統(tǒng)。 一種被標(biāo)記的一抗直接與底物反應(yīng)稱(chēng)為 一步染色法。但是很貴。此外，還可以通過(guò)標(biāo)記二抗對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行染色， 放大檢測(cè)信號(hào)，稱(chēng)為兩步法。還有一種三步法，標(biāo)記第三個(gè)抗體以獲得更好 的檢測(cè)信號(hào)放大。標(biāo)記基團(tuán)可以是HRP 或AP。 該基團(tuán)可以通過(guò)與不同底物 反應(yīng)而著色。DAB 是一種常見(jiàn)的染色底物。以下，我們執(zhí)行三步法，其中二 抗用生物素標(biāo)記，第三個(gè)抗體偶聯(lián)HRP。 最后，用蘇木精染色細(xì)胞核。
(1) 用PBS 中清洗切片2次，每次5 min。
(2) 配制新鮮的DAB, 使用前過(guò)濾。
(3) 在組織中加入DAB, 立即在顯微鏡下觀察染色情況。
(4) 當(dāng)組織有明顯染色時(shí)，必須及時(shí)在PBS 中清洗切片。
(5) 用蘇木精染色液染色細(xì)胞核，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)更清晰。
注意事項(xiàng)：
a. DAB 和蘇木精使用前應(yīng)過(guò)濾。
b. 使用前DAB 中應(yīng)加入新鮮的H2O。
c. 在顯微鏡下觀察標(biāo)記基團(tuán)與底物的反應(yīng)，及時(shí)終止顯色時(shí)間，時(shí)間不超過(guò)10分鐘。
6. 檢測(cè)
(1) 將切片在60℃下加熱至干燥，然后加入適量中性香脂密封組織；
(2) 在顯微鏡下觀察染色，在合適的視野下拍照。
常見(jiàn)問(wèn)題
1. 無(wú)染色
(1) 一抗和二抗不匹配，使用針對(duì)一抗的二抗(如一抗來(lái)自兔，二抗為抗兔 抗體)
(2) 沒(méi)有足夠的一抗與目標(biāo)蛋白結(jié)合，使用低稀釋度抗體。延長(zhǎng)4℃孵育時(shí) 間(如過(guò)夜)。
(3) 抗體的天然結(jié)構(gòu)受損，不適用于IHC, 用天然(非變性的)WB 法檢測(cè)抗 體，確?？贵w沒(méi)被損壞。
(4) 由于儲(chǔ)存不當(dāng)、稀釋或反復(fù)凍融造成一抗/二抗試劑盒失效，做陽(yáng)性對(duì) 照確認(rèn)一抗/二抗試劑盒的有效性。
(5) 靶組織中沒(méi)有目標(biāo)蛋白，參照抗體供應(yīng)商的建議做陽(yáng)性對(duì)照。
(6) 組織中沒(méi)有足夠的目標(biāo)蛋白，應(yīng)用信號(hào)放大操作。
(7) 沒(méi)有避光保存二抗，避免將二抗處于光照下。
(8) 脫蠟不徹底，延長(zhǎng)脫蠟時(shí)間，更換二甲苯。
(9) 固定步驟(使用福爾馬林和多聚甲醛固定劑)修飾了抗體識(shí)別表位，抗 原修復(fù)法暴露出抗原表位，縮短固定時(shí)間。
(10) 蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)(核蛋白),抗體不能穿透核膜,在封閉液和抗體稀 釋液中加入通透劑。
(11) PBS 緩沖液被細(xì)菌污染后破壞了靶蛋白的磷酸根在抗體PBS 儲(chǔ)存液 中加入0.01%疊氮化合物，或使用新鮮無(wú)菌的PBS。
2. 高背景
(1) 沒(méi)有封閉非特異性結(jié)合或封閉不充分，延長(zhǎng)封閉時(shí)間，并考慮更換封閉劑。
建議用10%正常血清封閉切片1小時(shí)或1-5% BSA 封閉培養(yǎng)細(xì)胞30 分鐘。
(2) 一抗?jié)舛冗^(guò)高
滴定法尋找到最佳抗體濃度，或在濃度較低抗體中延長(zhǎng)孵育時(shí)間(最 好是緩慢而準(zhǔn)確地結(jié)合)。
(3) 孵育溫度過(guò)高，4℃孵育切片或細(xì)胞
(4) 二抗發(fā)生了非特異性結(jié)合(被損壞),不加一抗，做二抗對(duì)照。
(5) 組織沖洗不徹底，有固定劑殘留，所有步驟都要用PBS 充分洗滌。
(6) 存在內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，用酶抑制劑如抑制堿性磷酸酶的鹽酸左旋咪唑 (2mM)，或抑制過(guò)氧化物酶的H2O2 (0.3%v/v)。(詳見(jiàn)IH 操作手冊(cè))。
(7) 固定過(guò)度(固定劑用福爾馬林和多聚甲醛)導(dǎo)致抗體識(shí)別抗原位點(diǎn)被 修飾，改變抗原修復(fù)方法，縮短與抗原修復(fù)液的孵育時(shí)間。
(8) 信號(hào)過(guò)度放大(信號(hào)放大技術(shù)),縮短信號(hào)放大孵育時(shí)間，稀釋信號(hào)擴(kuò) 大試劑盒。
(9) 底物過(guò)量(酶檢測(cè)法),縮短底物孵育時(shí)間
(10) 染料與PBS 在細(xì)胞/組織中相互作用(酶檢測(cè)法)
用Tris緩沖液沖洗切片后，再與底物孵育。孵育后，Tris緩沖液再次沖洗細(xì)胞/切片。
(11) 通透作用破壞膜并除去了膜蛋白，去除緩沖液中的通透劑。
3. 非特異性染色
(1) 一抗/二抗?jié)舛冗^(guò)高，降低抗體濃度和或縮短孵育周期。對(duì)比不表達(dá)目 標(biāo)蛋白細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度。
(2) 存在內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，用酶抑制劑如抑制堿性磷酸酶的鹽酸左旋咪唑 (2mM)，或抑制過(guò)氧化物酶的H2O2 (0.3% v/v)。(詳見(jiàn)IHC操作手冊(cè))。
(3) 一抗與被染組織同源(如用鼠一抗測(cè)鼠組織),加二抗后，二抗會(huì)與同源 的所有組織結(jié)合，應(yīng)用與組織非同源的一抗。
(4) 切片/細(xì)胞變干，保持切片/細(xì)胞濕度，切勿變干。
