在哺乳動物細胞中，DNA甲基化精密地調(diào)節(jié)基因的表達，從而在許多生理和病理過程中起著舉足輕重的作用。近期，來自中科院上海生命科學研究院“百人計劃“胡榮貴研究員帶領的研究小組，在《Cell Discovery》發(fā)表題為“A CRISPR-based approach for targeted DNA demethylation”的研究成果，報道了一種新的方法，采用目前廣泛使用的CRISPR-Cas系統(tǒng)來靶定DNA去甲基化。點擊閱讀胡榮貴研究組的更多研究成果：上海生科院發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)降解組的新方法；胡榮貴研究組Cancer Cell解析細胞選擇性自噬；中科院Cell Res繪制人類蛋白質(zhì)降解組圖譜。

DNA甲基化是向DNA添加甲基的一個后生過程，主要發(fā)生在CpG二核苷酸中胞嘧啶堿基的第五個碳上。在哺乳動物細胞中，DNA甲基化調(diào)控著基因的表達，從而在無數(shù)的生理和病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，其中包括，但不限于，細胞發(fā)育和分化、基因組印跡和腫瘤發(fā)生。通常，腫瘤抑制基因中的DNA甲基化，會沉默它們的表達，并將有助于多種類型的人類癌癥。另一方面，DNA甲基化也是許多毀滅性的人類神經(jīng)肌肉疾病的病因，包括脆性X染色體綜合征，其中FMRP的啟動子區(qū)中三核苷酸重復（CGG）的擴增，可導致基因的超甲基化，并大幅抑制該基因的表達。因此，操縱靶基因DNA甲基化狀態(tài)的技術(shù)進步，不僅有助于我們理解DNA甲基化如何在特定背景下調(diào)節(jié)基因的表達，而且能控制基因表達，并可能帶來有益的臨床預后。

最近，有研究發(fā)現(xiàn)許多酶能夠以不同的機制催化活性的DNA去甲基化。據(jù)報道，Tet加雙氧酶催化的5-甲基胞嘧啶氧化，可促使具有Tet催化結(jié)構(gòu)域（Tet-CD）的DNA去甲基化，作為最小的功能模塊。研究人員曾嘗試利用轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物-融合的TET1-CD靶定DNA去甲基化，來激活靶基因。然而，它更廣泛的作用被限制為基于轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物的策略，需要繁瑣的設計和組裝，從而不適合于高通量應用。

近年來，CRISPR系統(tǒng)已被廣泛應用于基因組工程與編輯。利用失活的核酸內(nèi)切酶Cas9（dCas9），開發(fā)的合成生物學平臺已經(jīng)實現(xiàn)了基因調(diào)控、基因組編輯或熒光標記。此外，在sgRNA中意外發(fā)現(xiàn)的可塑性，可使額外的RNA元件插入形成sgRNA2.0系統(tǒng)。一般而言，這種RNA元件可被許多RNA特異結(jié)合蛋白效應物識別，這將可能導致靶向dCas9介導的功能基團的效力放大。

在這項研究中，研究人員報道了一種新的方法，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)，靶定DNA去甲基化。最初，研究人員通過向傳統(tǒng)sgRNAs中插入兩個拷貝的噬菌體MS2 RNA元件，構(gòu)建了修改的單導向RNAs（sgRNAs）（sgRNA2.0），這將有利于Tet1催化結(jié)構(gòu)域（TET CD），與dCas9或MS2外殼蛋白融合，結(jié)合到基因位點。

隨后，研究人員證明，該系統(tǒng)可顯著上調(diào)靶基因的轉(zhuǎn)錄，包括RANKL、MAGEB2或MMP2，這與它們鄰近的啟動子中的CpG的DNA去甲基，是密切相關(guān)的。此外，dCas9/sgRNA2.0指導的去甲基化系統(tǒng)，似乎能提供有效的靶基因去甲基化，但是具有脆弱的脫靶效應。該系統(tǒng)的應用，不僅可以幫助我們理解“在具體背景中DNA甲基化如何可以調(diào)節(jié)基因表達”的機制，而且也使我們能夠控制基因表達，并帶來潛在的臨床益處。