1. 組蛋白修飾檢測方法

組蛋白修飾分析是一系列實(shí)驗(yàn)方法，用于分析和確定組蛋白的修飾狀態(tài)和位置，主要包括染色質(zhì)免疫沉淀（CHIP）和質(zhì)譜（MS）。這些方法利用特定的實(shí)驗(yàn)策略和工具，檢測帶有特定修飾的組蛋白分子，并定量確定它們的存在量和分布。

1.1 染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（ChIP）

ChIP是一種常用的組蛋白修飾檢測技術(shù)，用于檢測修飾的存在及其與基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)。該技術(shù)使用特異性抗體結(jié)合修飾的組蛋白，將修飾的組蛋白從細(xì)胞或組織中富集出來。然后，可以通過PCR、測序或質(zhì)譜等方法對富集的修飾組蛋白進(jìn)行進(jìn)一步分析，確定修飾的存在和定位。

在檢測組蛋白修飾方面，有三種主要的基于ChIP的方法，包括ChIP-chip、ChIP-SAGE和ChIP-Seq。

在ChIP中，有兩種類型的ChIP：天然ChIP和交聯(lián)ChIP。天然ChIP使用通過核酸酶消化細(xì)胞核制備的天然染色質(zhì)。交聯(lián)ChIP使用甲醛固定的染色質(zhì)，并通過聲波破碎進(jìn)行斷裂。在表1中，我們對比了這兩種ChIP方法。

表1： 天然ChIP和交聯(lián)ChIP的比較

此外，您可以點(diǎn)擊以下鏈接查看ChIP操作具體流程：

天然染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)方案

交聯(lián)染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)方案

1.1.1 ChIP-chip

ChIP-chip（染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)合DNA微陣列雜交）是一種將染色質(zhì)免疫沉淀與DNA微陣列相結(jié)合的技術(shù)。與常規(guī)的ChIP一樣，ChIP-chip用于研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA的相互作用。實(shí)際上，ChIP-chip方法可用于研究許多表觀基因組現(xiàn)象。這里出現(xiàn)的示例展示了ChIP-chip在研究組蛋白修飾中的應(yīng)用。正如圖1所示：

首先，通過使用特定于特定組蛋白修飾的抗體免疫沉淀交聯(lián)染色質(zhì)來純化修飾的染色質(zhì)。然后，DNA被擴(kuò)增以獲得足夠的DNA（用一種顏色標(biāo)記）。用顏色標(biāo)記的ChIP DNA與從輸入染色質(zhì)中準(zhǔn)備的控制DNA混合，并用不同顏色標(biāo)記。隨后，微陣列探針可以映射到基因組上，得出基因組坐標(biāo)。然而，大多數(shù)ChIP-on-chip實(shí)驗(yàn)仍然使用多克隆抗體，這些抗體在批次之間的特異性不同。因此，生成和使用單克隆抗體進(jìn)行ChIP-on-chip實(shí)驗(yàn)是一個(gè)重要目標(biāo)。

1.1.2 ChIP-SAGE

ChIP-SAGE是指染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)合串聯(lián)分析基因表達(dá)。將ChIP實(shí)驗(yàn)與SAGE結(jié)合，可以在基因組范圍內(nèi)描述組蛋白修飾。ChIP-SAGE過程始于ChIP步驟，用于純化與特定組蛋白修飾相關(guān)的染色質(zhì)區(qū)域，然后按照以下步驟進(jìn)行。如圖2所示：

首先，交聯(lián)被逆轉(zhuǎn)，接著將生物素化的通用連接器（UL）連接到DNA末端，并將DNA結(jié)合到鏈霉親和素珠上。然后，使用識(shí)別CATG的Nla III酶消化DNA，將包含Mme I識(shí)別序列的連接器連接到切割的DNA末端。Mme I酶消化產(chǎn)生來自免疫沉淀片段的21-22 bp序列標(biāo)簽；這些序列標(biāo)簽被連接在一起，克隆到測序載體中，然后進(jìn)行測序。每個(gè)測序反應(yīng)中通?？梢陨纱蠹s20到30個(gè)21 bp的短序列標(biāo)簽。然后，這些序列標(biāo)簽可以映射到基因組上，以識(shí)別修飾區(qū)域。

1.1.3 ChIP-Seq

ChIP-seq（染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)合高通量測序技術(shù)）是近年來在基因組尺度上研究表觀遺傳現(xiàn)象的最令人興奮的技術(shù)之一，它依賴于將ChIP實(shí)驗(yàn)與高通量測序技術(shù)相結(jié)合。ChIP-seq將ChIP與高通量DNA測序相結(jié)合，用于鑒定DNA相關(guān)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。如圖3所示：

這里概述的過程是針對使用Illumina Genome Analyzer和Solexa技術(shù)的。它可以分為兩個(gè)部分，ChIP和測序。第一步是使用特定于特定組蛋白修飾的抗體對修飾的染色質(zhì)進(jìn)行免疫沉淀。然后，修飾的ChIP DNA末端經(jīng)修復(fù)，并與一對適配器連接，隨后進(jìn)行有限的PCR擴(kuò)增。DNA分子結(jié)合到一個(gè)包含共價(jià)結(jié)合的寡核苷酸的流動(dòng)細(xì)胞表面，這些核苷酸可以識(shí)別適配器序列。經(jīng)過尺寸選擇，所有產(chǎn)生的ChIP-DNA片段都可以使用基因組測序儀同時(shí)進(jìn)行測序。得到的序列讀數(shù)被映射到參考基因組上，以獲得與免疫沉淀片段對應(yīng)的基因組坐標(biāo)。

1.2 質(zhì)譜法（MS）

質(zhì)譜法近年來已成為鑒定和定量組蛋白修飾的首選方法。通過質(zhì)譜法鑒定和定位特定殘基的組蛋白修飾依賴于肽或蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)測量質(zhì)量和預(yù)期質(zhì)量之間的"質(zhì)量差"。理論上，這種方法使得在單次分析中可以對任何PTM或PTM組合進(jìn)行概要分析，而不受PTM類型或其特定位點(diǎn)的限制，并提供高度準(zhǔn)確的定量數(shù)據(jù)。

質(zhì)譜法已被證明是評(píng)估和比較不同樣本中特定修飾及其組合水平的有價(jià)值工具。

在生物樣本中，有三種基于質(zhì)譜法的方法可用于檢測組蛋白修飾，包括“自上而下”、“中間范圍”和“自下而上”的質(zhì)譜法 ^[5-8]。

1.2.1 “自上而下”方法

在“自上而下”方法中，完整的組蛋白被色譜分離，然后被離子化并進(jìn)行質(zhì)譜分析 ^[5,8]。由于完整組蛋白的高電荷狀態(tài)，可以從13+到25+不等，所以高分辨率的質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜對于這種技術(shù)至關(guān)重要。這個(gè)過程提供了在給定樣本中所有組蛋白同工型以及它們的總體化學(xué)計(jì)量學(xué)的詳細(xì)數(shù)據(jù)。

1.2.2 “中間范圍”方法

在“中間范圍”方法中，通過Glu-C或Asp-N的消化生成長的組蛋白肽，通常分子量超過5 kDa（>20個(gè)氨基酸）^[5,8]。通過這種方法，可以獲得完整的N-末端尾巴。例如，Asp-N產(chǎn)生H4 1–24肽，而Glu-C產(chǎn)生H3 1–50肽，其中包括了H4和H3中大多數(shù)著名PTM位點(diǎn)。盡管這兩種方法適合于檢測長程PTM關(guān)聯(lián)并估計(jì)其豐度，但是這兩種方法面臨的一個(gè)主要困難是區(qū)分異構(gòu)肽（具有相同修飾但位于不同位置的肽段），此外，這些方法通常面臨靈敏度降低和計(jì)算密集型數(shù)據(jù)分析的困擾。因此，“自上而下”和“中間范圍”質(zhì)譜法通常只在少數(shù)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，并且截至目前尚未有在臨床樣本中應(yīng)用的記錄。

1.2.3 “自下而上”方法

在“自下而上”質(zhì)譜法中，組蛋白在通過質(zhì)譜分析之前，經(jīng)過Arg‐C蛋白酶介導(dǎo)的酶促消化為相對較短的肽（長度為5-20個(gè)氨基酸）。由于核心組蛋白富含堿性氨基酸殘基，胰蛋白酶產(chǎn)生的肽太短，并且在修飾位點(diǎn)附近低效切割，導(dǎo)致長度不一致，不適合準(zhǔn)確定量。在胰蛋白酶切割之前，通過氘化乙酸酐或丙酸酐在N-末端和賴氨酸上的游離胺衍生通常用于模擬Arg-C消化，同時(shí)使用強(qiáng)大的胰蛋白酶 ^{[9-12]。這種策略也有助于區(qū)分等壓肽 [10]。}

雖然“自下而上”提供有限的同時(shí)發(fā)生的PTM數(shù)據(jù)（最多四個(gè)），特別是對于遠(yuǎn)處的標(biāo)記，但它提供了靈活性，并在分析患者來源的樣本中具有應(yīng)用。

2. 組蛋白修飾檢測的應(yīng)用

組蛋白修飾檢測在表觀遺傳學(xué)研究和個(gè)體化醫(yī)學(xué)中至關(guān)重要。它有助于理解基因調(diào)控機(jī)制，探索細(xì)胞分化和組織發(fā)育過程，識(shí)別疾病生物標(biāo)志物，并開發(fā)靶向治療方法。

2.1 揭示基因調(diào)控機(jī)制

組蛋白修飾檢測可以幫助我們揭示基因調(diào)控機(jī)制。通過分析基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中不同修飾的分布，我們可以了解組蛋白修飾在基因表達(dá)中的調(diào)節(jié)作用，并進(jìn)一步了解基因調(diào)控的詳細(xì)機(jī)制。

2.2 研究發(fā)育和細(xì)胞命運(yùn)決定

組蛋白修飾檢測在發(fā)育過程和細(xì)胞命運(yùn)決定中發(fā)揮重要作用。通過分析修飾的動(dòng)態(tài)變化，我們可以研究細(xì)胞分化和組織發(fā)育的分子機(jī)制，以及干細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控。

2.3 探索疾病發(fā)病機(jī)制

組蛋白修飾的檢測幫助我們了解疾病的機(jī)制。不同疾病中異常的組蛋白修飾模式可以為疾病的發(fā)生和發(fā)展提供重要線索，從而為疾病的診斷和治療提供新的靶標(biāo)和策略。

參考文獻(xiàn)：

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