1、原代細(xì)胞

1.1 什么是原代細(xì)胞？

原代細(xì)胞是指直接從有機(jī)生命體活檢樣本或者血液中通過(guò)酶解或物理方法獲得單細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)，一般將培養(yǎng)到第1代至第10代的原代細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。在人工創(chuàng)造的環(huán)境下原代細(xì)胞可以存活、生長(zhǎng)、繁殖和傳代，并用于細(xì)胞生命過(guò)程、細(xì)胞癌變、細(xì)胞工程等問(wèn)題的研究。

1.2 原代細(xì)胞優(yōu)缺點(diǎn)

原代細(xì)胞經(jīng)歷最小的群體倍增，因此保留其原始組織的表型和基因型特征，包括生長(zhǎng)和衰老。它們最接近也最能反映體內(nèi)生長(zhǎng)特性，適合于藥物敏感性試驗(yàn)和細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)研究。

然而，從組織中分離原代細(xì)胞既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，而且每種細(xì)胞類型對(duì)營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子需求都不同。此外，原代細(xì)胞自我更新和分化的潛力有限，它們的形態(tài)和功能可能在培養(yǎng)過(guò)程中隨著時(shí)間的變化代謝緩慢，因此建議使用處于細(xì)胞分裂早期的原代細(xì)胞。

1.3 初代培養(yǎng)

原代細(xì)胞培養(yǎng)又稱原代培養(yǎng)，是對(duì)供體組織細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)的第一步，也是建立細(xì)胞系的基本技術(shù)首步。

● 組織塊培養(yǎng)法

組織塊培養(yǎng)是一種常用的、簡(jiǎn)單的、成功的原代培養(yǎng)方法?；痉椒ㄊ菍⑾盖邢碌男〗M織塊接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶壁可預(yù)先涂上一層薄薄的膠原蛋白，促進(jìn)組織塊與瓶壁粘附，進(jìn)一步促進(jìn)周圍細(xì)胞沿瓶壁向外生長(zhǎng)。

● 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法

懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、癌細(xì)胞、胸膜和腹水中的免疫細(xì)胞，不需要消化。可直接采用低速離心培養(yǎng)，也可在淋巴細(xì)胞分離后接種培養(yǎng)。

● 器官培養(yǎng)

從供體獲得的器官或組織塊直接在特定的環(huán)境條件下體外培養(yǎng)，不需要組織隔離。這種培養(yǎng)方法稱為器官培養(yǎng)。器官培養(yǎng)可以保持器官組織的相對(duì)完整性，可用于重點(diǎn)觀察器官組織的細(xì)微連接、排列和相互作用，以及對(duì)局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)。

2、細(xì)胞系

2.1 什么是細(xì)胞系？

細(xì)胞系是指原代細(xì)胞首次培養(yǎng)成功并可以長(zhǎng)時(shí)間傳代繁殖的細(xì)胞群。在其生存過(guò)程中，具有最高生長(zhǎng)能力的細(xì)胞將占主導(dǎo)地位，從而產(chǎn)生可以達(dá)到某種基因型和表型的細(xì)胞群。

細(xì)胞系可分為有限細(xì)胞系和無(wú)限細(xì)胞系。有限細(xì)胞系的壽命有限，在衰老前可以傳代 20-80 次。無(wú)限細(xì)胞系具有無(wú)限繁殖的能力，即永生化。 來(lái)源于宮頸癌細(xì)胞的HeLa細(xì)胞系是最著名的永生細(xì)胞系，也是醫(yī)學(xué)研究的重要工具。

細(xì)胞系已成為廣泛應(yīng)用的有價(jià)值的工具，包括藥物代謝和細(xì)胞毒性測(cè)試、基因功能研究、疫苗生產(chǎn)、抗體、人造組織的產(chǎn)生和生物化合物的合成^[4-6]。

2.2 優(yōu)缺點(diǎn)

細(xì)胞系是在原代細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，通過(guò)傳代和選擇獲得。常用的細(xì)胞系是通過(guò)篩選獲得的穩(wěn)定的細(xì)胞群，其特性可以保證在進(jìn)行連續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)得到更穩(wěn)定的結(jié)果。

它們供應(yīng)充足且相當(dāng)容易培養(yǎng)，通常具有克隆性和高度同質(zhì)性，解決了原代細(xì)胞培養(yǎng)中壽命短和擴(kuò)增受限的問(wèn)題。研究中常使用永生細(xì)胞系替代原代細(xì)胞，它們具有成本效益且易于使用，可提供無(wú)限量的材料供應(yīng)，并避免了與使用動(dòng)物和人體組織相關(guān)的倫理問(wèn)題。

然而，細(xì)胞系的缺點(diǎn)也是非常明顯的，細(xì)胞系容易發(fā)生自發(fā)突變與誘導(dǎo)突變。多次傳代后，細(xì)胞系可能會(huì)發(fā)生一些基因型甚至表型的變化。一旦細(xì)胞系發(fā)生突變，與原始供體細(xì)胞相比，它們將變得完全無(wú)法識(shí)別。另一個(gè)問(wèn)題是細(xì)胞污染。全世界使用的細(xì)胞系中約有 15-20% 被錯(cuò)誤識(shí)別或被其他細(xì)胞類型污染。

2.3 細(xì)胞譜系的錯(cuò)誤識(shí)別及污染

實(shí)際上，一些細(xì)胞系與原代細(xì)胞僅表現(xiàn)出較小相似性是由于基因型和表型經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代和增殖發(fā)生變異。細(xì)胞系是由基因操縱的，但是外部因素的刺激可能會(huì)導(dǎo)致其表型、原生功能等此產(chǎn)生響應(yīng)性改變。與原代細(xì)胞相比，永生細(xì)胞系存在重要的表型差異，并且可能因修飾和傳代而失去生理特性。盡管如此，作為一種簡(jiǎn)單有效的工具，細(xì)胞系仍然是學(xué)術(shù)界和制藥業(yè)的主要研究手段。不得不說(shuō)，永生癌細(xì)胞系是研究癌癥生物學(xué)和測(cè)試抗癌療法的寶貴模型。

3、干細(xì)胞

近年來(lái)在生物制藥領(lǐng)域，學(xué)者們的研究思路逐漸從基于原代細(xì)胞和細(xì)胞系系統(tǒng)轉(zhuǎn)向更加穩(wěn)健、現(xiàn)實(shí)和個(gè)性化的干細(xì)胞系統(tǒng)。

干細(xì)胞是指未分化的但可以在身體需要時(shí)變成特定的細(xì)胞。與原代細(xì)胞和細(xì)胞系相比，它們具有無(wú)限的增殖能力和可塑性，可以產(chǎn)生各種細(xì)胞類型和自我更新的能力，在發(fā)育生物學(xué)、疾病建模和細(xì)胞治療方面顯示出巨大的潛力。

根據(jù)干細(xì)胞的發(fā)育潛能，可以將其分為三種類型:全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞和單能干細(xì)胞。按照發(fā)育階段，干細(xì)胞可分為兩類:胚胎干細(xì)胞，成體干細(xì)胞。

常見(jiàn)的干細(xì)胞類型主要有以下幾種

3.1 胚胎干細(xì)胞

胚胎干細(xì)胞（ESCs）是指通過(guò)體外抑制培養(yǎng)從胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖細(xì)胞中選出的細(xì)胞。 1998 年，研究人員在囊胚階段從內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出第一個(gè)人類胚胎干細(xì)胞系。 2007 年，成人細(xì)胞被重新編程為多能干細(xì)胞，稱為人類誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞 (iPSC)。

在未分化狀態(tài)下，多能干細(xì)胞也是發(fā)育毒理學(xué)的重要體外模型。眾所周知，胚胎發(fā)育是一個(gè)特別易受藥物和有毒化合物侵害的時(shí)期，動(dòng)物模型很難概括藥物對(duì)人類發(fā)育早期事件的影響，而多能干細(xì)胞由于其特性，為研究胚胎發(fā)生過(guò)程中的藥物毒性提供了一個(gè)獨(dú)特且可行的平臺(tái)。

此外，多能干細(xì)胞分化成所有細(xì)胞類型的能力對(duì)于研究稀有或難以分離的細(xì)胞類型（如神經(jīng)元或心肌細(xì)胞）非常有價(jià)值。相關(guān)研究表明，多能干細(xì)胞在疾病建模、藥物篩選和毒性測(cè)試方面有很大幫助。最后，人類誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞還可以創(chuàng)建疾病個(gè)性化的細(xì)胞模型，以幫助研究糖尿病、囊性纖維化、帕金森病和精神分裂癥等疾病。例如，來(lái)自家族性自主神經(jīng)功能障礙患者的 iPSC 的神經(jīng)嵴前體細(xì)胞，這是一種影響神經(jīng)嵴細(xì)胞譜系生成的罕見(jiàn)、致命的遺傳疾病，前體細(xì)胞用于篩選新藥，幫助設(shè)計(jì)更安全、更有效治療。

胚胎干細(xì)胞的相關(guān)靶點(diǎn)：

• CD15
• CD24
• CD29
• CD31
• CD59
• CD9
• c-kit
• c-Myc
• Cripto
• E-Cadherin
• Frizzled 5
• Integrin alpha 6
• KIF4A
• Lin28A
• LIN28B
• Nanog
• SOX2
• SSEA-3
• SSEA-4
• v-Myc

3.2 成體干細(xì)胞

成體干細(xì)胞是存在于分化組織中的未分化細(xì)胞，能夠自我更新并專門(mén)形成構(gòu)成該類型組織的細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (BM-MSCs) 和造血干細(xì)胞 (HSCs) 是從成人組織中分離出來(lái)的具有自我更新能力的成人干細(xì)胞。這些多能成體干細(xì)胞被廣泛用作預(yù)測(cè)藥物毒性的體外細(xì)胞模型。

3.3 多能干細(xì)胞（hPCGs）

人類胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞統(tǒng)稱為多能干細(xì)胞，具有自我更新能力并且可以分化為三個(gè)胚層（內(nèi)胚層、中胚層和外胚層）細(xì)胞類型。這些特性使它們成為評(píng)估藥物和有毒化合物的有力工具。多能干細(xì)胞具有無(wú)限的增殖和發(fā)育潛力，在三個(gè)胚層中均產(chǎn)生類器官。多能干細(xì)胞衍生的類器官可以進(jìn)行大規(guī)模研究，例如代謝分析和藥物篩選。 人體胚胎干細(xì)胞（hESCs）來(lái)自囊胚，是受精后 5-6 天發(fā)育中的胚胎。至于 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC），它們來(lái)源于多能因子異位表達(dá)的重編程體細(xì)胞，例如： OSKM (OCT4/SOX2/KLF4/C-MYC)。

多能干細(xì)胞的相關(guān)靶點(diǎn)：

• ABCG2
• ASCL1
• BMI1
• CALCR
• CDCP1
• CDH2
• CTNNB1
• CXCR4
• FABP3
• FABP7
• FGFR2
• FGFR4
• FOXD3
• FZD9
• GATA2
• GNL3
• HOXB1
• ID2
• LRTM1
• MSI1
• MSI2
• METRN
• MSX1
• NES
• NFE2L2
• NOG
• NOTCH1
• NOTCH2
• NEUROD1
• NR2F1
• NUMB
• SOX21
• OTX2
• PAX3
• PAX6
• PRKCZ
• PROM1
• ROR2
• RUNX1
• SFRP2
• SLC2A1
• SMARCA4
• SLAIN1
• SOX11
• SOX9
• TRAF4

參考文獻(xiàn)：

[1] Hudu S. A., Alshrari A. S., et al. (2016). Cell culture, technology: Enhancing the culture of diagnosing human diseases [J]. J. Clin. Diagnost. Res. 10 DE01–DE05.

[2] Jedrzejczak-Silicka M. (2017). “History of Cell Culture,” in New Insights into Cell Culture Technology [J]. eds Joghi S., Gowder T. (London: IntechOpen; ).

[3] Ledur P. F., Onzi G. R., et al. (2017). Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: what is the impact for novel discoveries [J]? Oncotarget 8 69185–69197.

[4] Go′mez-Lecho′n MJ, Donato MT, et al. Human hepatocytes as a tool for studying toxicity and drug metabolism [J]. Curr Drug Metab. 2003;4:292–312.

[5] MacDonald C. Development of new cell lines for animal cell biotechnology [J]. Crit Rev Biotechnol. 1990;10:155–78.

[6] Schurr MJ, Foster KN, et al. Phase I/II clinical evaluation of StrataGraft: a consistent, pathogen-free human skin substitute [J]. J Trauma. 2009;66:866–73, discussion 873-4.